刺梨的化学成分鉴定及其抗菌活性

梁梦琳， 李 清， 龙勇兵， 李 阳， 李 萍， 袁小红

(西南科技大学 生命科学与工程学院， 四川 绵阳 621000)

刺梨(RosaroxbunghiiTratt)又名缫丝花、文先果、送春归，是蔷薇科蔷薇属多年生落叶灌木[1]，为中国云贵高原特有的野生资源。刺梨具有很高的营养价值，富含维生素C、黄酮、三萜、有机酸、多糖、多酚等物质[2-6]，其中维生素C含量居水果之首[4]。传统医学常把刺梨用于消食健胃、止泻、维生素C缺乏症等[7]。现代医学研究表明，刺梨汁能减轻拘束负荷诱发自由基对肝组织的损伤，改善肝组织机能[8]；刺梨提取物能够抑制胃癌细胞的生长[9-10]；刺梨冻干粉能够明显减轻单侧输尿管梗阻(UUO)模型大鼠肾功能的损害，以及输尿管梗阻导致的肾纤维化[11]；刺梨汁在改善动脉粥样硬化方面亦有明显作用[12]。此外，刺梨还具有抗炎、增强免疫、延缓衰老、降低机体内重金属负荷等作用[13-14]。

近年来，刺梨已成为国内饮料、营养保健品产业的一种重要原料，其广泛的药食两用价值日益受到关注。但目前对刺梨的研究，大多集中在粗提物效果的评价，很多有效成分未得到充分的研究和利用，难以应用于实际生产中。为此，笔者对刺梨活性成分进行分离鉴定，并测定其抗菌活性，进一步阐明刺梨能够发挥一些生物活性的物质作用基础，为刺梨资源的开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 新鲜刺梨与菌株

新鲜刺梨，购自贵州六盘水。金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)，均由西南科技大学生命科学与工程学院生物实验室提供。

1.2 仪器与试剂

XJ-2小型提取浓缩机组(天津大明制药设备厂)，Finnigan LCQDECA质谱仪(美国阿美特克公司)，Bruker Avance-600 核磁共振仪(德国布鲁克公司)，制备高效液相色谱仪(江苏汉邦公司)，制备柱(C-18柱，250 mm×10.0 mm，5 μm，Servo公司)，中压制备色谱仪(瑞士BUCHI公司)，柱层层析硅胶(200～300目)、聚酰胺柱层析(60～90目)、薄层层析硅胶板(青岛海洋化工有限公司)，SephadexLH-20 葡聚糖凝胶(瑞士Pharmacia 公司)，β-谷甾醇对照品(成都瑞芬思生物科技有限公司)，试验所用试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3 刺梨提取液分离鉴定

取新鲜刺梨150 kg，用等体积70%乙醇(12 h，4次)提取，提取液浓缩成浸膏13 kg。总浸膏用水稀释后再用乙酸乙酯萃取3次，萃取液合并，减压浓缩，得乙酸乙酯部分700 g。乙酸乙酯部分过聚酰胺柱层析，二氯甲烷-乙醇(2∶1、1∶1、0∶1)梯度洗脱，薄层层析硅胶板点样，采用紫外、硫酸香草醛显色等方法观察检测流分，合并相似流分，得到Fr.1和Fr.2。Fr.1通过柱层层析硅胶，二氯甲烷-乙醇(100∶0、20∶1、10∶1、5∶1、1∶1、0∶100)梯度洗脱，薄层层析硅胶板点样合并后得到5个组分(Fr1.1～Fr1.5)。取部分Fr1.2组分通过反复柱层层析硅胶以及高效液相制备色谱得到化合物1(1 g，制备条件：甲醇-水为60∶40，流速为3.0 mL/min)，化合物2(16 mg，制备条件：甲醇-水为80∶20，流速为 3.5 mL/min)，化合物7(500 mg，重结晶)。取部分Fr1.5组分过中压反相柱层析(条件：甲醇-水为60∶40，流速为10.0 mL/min)以及制备色谱(条件：甲醇-水为65∶35，流速为2.0 mL/min)得到化合物3(18 mg)、化合物4(240 mg)、化合物5(27 mg)和化合物6(13 mg)。

1.4 抗菌活性测定

参考文献[15]的方法并加以改进，配制终浓度为108cfu/mL的菌悬液，采用刃天青96孔板微量稀释法，对3～6号化合物进行大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、肠炎沙门氏菌抑菌试验。检测前，分别将供试化合物和硫酸新霉素溶于二甲基亚砜(DMSO)中，制成浓度1.0 mg/mL。以硫酸新霉素为阳性对照，并以刃天青溶液(100 μg/mL)为指示剂。在96孔板第11列每孔中加100 μL刃天青溶液。将刃天青溶液7.5 mL和5 mL菌悬液(108cfu/mL)混匀，转移混合液100 μL到96孔板其余孔中。转移待测化合物溶液 100 μL 到其中一行的第1个孔中，混匀后从此孔转移100 μL到同一行的第2个孔中，混匀后再从第2个孔转移100 μL 到第3个孔中，以此类推直至第10个孔为止，第10个孔的液体混匀后抽取100 μL扔掉，使每孔浓度均为前一孔的一半，第11孔为阳性对照。最后将96孔板在37℃下培养5 h，有活性的标志为从蓝色到粉红色；发生颜色变化的最低稀释浓度即为待测化合物的最低抑菌浓度(MIC)，3次独立试验的MIC值作为最终MIC值。

2 结果与分析

2.1 化合物结构鉴定

在贵州剌梨中共鉴定出7种化合物，其具体结构见图1。

2.1.1 化合物1白色针状结晶1H-NMR(600 MHz，CD3OD):δ5.29(1H，t，J=3.4 Hz，H-12)，3.93(1H，m，H-3)，3.33(1H，d，J=2.5 Hz，H-2)，2.51(1H，s，H-18)，1.35(3H，s，CH3-27)，1.28(3H，s，CH3-29)，1.19(3H，s，CH3-25)，0.99(6H，s，CH3-23)，0.93(3H，d，J=6.6 Hz，CH3-30)，0.87(3H，s，CH3-26)，0.79(3H，s，CH3-24)，13C-NMR(100 MHz，CD3OD):δ42.4(C-1)，67.1(C-2)，80.1(C-3)，41.2(C-4)，49.2(C-5)，24.6(C-6)，34.1(C-7)，39.3(C-8)，49.0(C-9)，39.4(C-10)，27.2(C-11)，129.3(C-12)，140.1(C-13)，42.7(C-14)，29.5(C-15)，26.6(C-16)，48.1(C-17)，55.1(C-18)，73.6(C-19)，43.0(C-20)，19.2(C-21)，39.0(C-22)，29.2(C-23)，22.4(C-24)，17.5(C-25)，16.6(C-26)，27.1(C-27)，182.5(C-28)，24.9(C-29)，16.8(C-30)。对照文献[16]的数据，确定化合物为蔷薇酸(Euscaphic acid)。

2.1.2 化合物2白色粉末1H-NMR(600 MHz，CD3OD):δ5.28(1H，s，H-12)，3.65(1H，dd，J=9.6，3.0 Hz，H-2)，3.46(1H，d，J=9.6 Hz，H-1)，3.40(1H，d，J=3.0 Hz，H-3)，2.00(1H，dd，J=11.0，6.7 Hz，H-9)，1.35(3H，s，CH3-27)，1.20(3H，s，CH3-23)，1.01(3H，s，CH3-25)，0.97(3H，s，CH3-29)，0.93(3H，J=6.7 Hz，CH3-30)，0.88(3H，s，CH3-24)，0.81(3H，s，CH3-26),13C-NMR(100 MHz，CD3OD):δ81.3(C-1)，71.8(C-2)，80.7(C-3)，42.5(C-4)，49.7(C-5)，19.4(C-6)，34.2(C-7)，41.8(C-8)，49.8(C-9)，44.4(C-10)，27.1(C-11)，130.5(C-12)，138.9(C-13)，29.7(C-14)，29.1(C-15)，26.7(C-16)，49.0(C-17)，55.0(C-18)，73.7(C-19)，43.0(C-20)，27.3(C-21)，39.0(C-22)，28.2(C-23)，22.3(C-24)，12.9(C-25)，17.8(C-26)，24.9(C-27)，178.5(C-28)，26.7(C-29)，16.6(C-30)。对照文献[17]的数据，确定化合物为1α，2β，3β，19α-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic acid。

图1化合物1～7的结构

2.1.3 化合物3白色粉末ESI-MS m/z 673[M+Na]+；1H-NMR(400 MHz，CD3OD):δ5.39(1H，d，J=8.0 Hz，glcH-1)，5.36(1H，m，H-12)，1.33(3H，s，CH3-27)，1.01(6H，s，CH3-23，CH3-26)，0.97(3H，s，CH3-29)，0.96(3H，s，CH3-25)，0.89(3H，s，CH3-30)，0.76(3H，s，CH3-24)；13C-NMR(100 MHz CD3OD):δ41.3(C-1)，65.7(C-2)，78.7(C-3)，38.1(C-4)，48.2(C-5)，17.9(C-6)，31.9(C-7)，39.7(C-8)，47.4(C-9)，38.1(C-10)，23.5(C-11)，123.5(C-12)，143.0(C-13)，41.0(C-14)，27.8(C-15)，27.0(C-16)，45.7(C-17)，43.7(C-18)，81.1(C-19)，34.5(C-20)，28.0(C-21)，32.4(C-22)，28.1(C-23)，20.9(C-24)，15.4(C-25)，16.4(C-26)，23.7(C-27)，177.2(C-28)，27.2(C-29)，23.7(C-30)，94.4(C-1’)，72.5(C-2’)，76.9(C-3’)，69.7(C-4’)，77.3(C-5’)，61.0(C-6’)。对照文献[18]的数据，确定化合物为2α，3α，19α-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid-28-O-β-D-glucopyranoside。

2.1.4 化合物4白色针状结晶ESI-MS m/z 673[M+Na]+;1H-NMR(400 MHz，CD3OD):δ5.35(1H，d，J=2.9 Hz，glc H-1)，5.34(1H，m，H-12)，2.54(1H，s，H-18)，1.31(3H，s，CH3-27)，1.27(3H，s，CH3-29)，1.02(3H，s，CH3-25)，1.01(3H，s，CH3-23)，0.95(3H，s，CH3-30)，0.89(3H，s，CH3-26)，0.79(3H，s，CH3-24)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD):δ41.2(C-1)，65.8(C-2)，78.7(C-3)，37.9(C-4)，48.1(C-5)，21.1(C-6)，32.6(C-7)，40.0(C-8)，46.8(C-9)，38.1(C-10)，23.4(C-11)，128.2(C-12)，138.3(C-13)，41.5(C-14)，28.2(C-15)，25.1(C-16)，45.7(C-17)，53.6(C-18)，72.3(C-19)，41.4(C-20)，25.8(C-21)，36.9(C-22)，27.8(C-23)，17.9(C-24)，16.3(C-25)，15.5(C-26)，23.3(C-27)，177.1(C-28)，25.7(C-29)，15.2(C-30)，94.4(C-1’)，72.5(C-2’)，77.2(C-3’)，69.7(C-4’)，76.9(C-5’)，61.0(C-6’)。对照文献[19]的数据，确定化合物为刺梨苷(kaiiichigeside F1)。

2.1.5 化合物5白色针状结晶ESI-MS m/z 673[M+Na]+；1H-NMR(400 MHz，CD3OD):δ5.11(1H，d，J=2.9 Hz，glc H-1)，5.10(1H，m，H-12)，2.30(1H，s，H-18)，1.10(6H，s，CH3-27，CH3-29)，0.79(6H，s，CH3-23，CH3-25)，0.71(3H，s，CH3-30)，0.59(3H，s，CH3-26)，0.56(3H，s，CH3-24)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD):δ47.9(C-1)，68.1(C-2)，83.1(C-3)，37.8(C-4)，55.3(C-5)，18.3(C-6)，32.7(C-7)，39.9(C-8)，47.3(C-9)，39.1(C-10)，23.3(C-11)，128.1(C-12)，138.3(C-13)，41.3(C-14)，28.3(C-15)，25.1(C-16)，46.8(C-17)，53.6(C-18)，72.5(C-19)，41.5(C-20)，25.8(C-21)，36.9(C-22)，27.9(C-23)，16.3(C-24)，16.1(C-25)，15.8(C-26)，23.4(C-27)，177.1(C-28)，25.7(C-29)，15.2(C-30)，94.4(C-1’)，72.3(C-2’)，77.2(C-3’)，69.7(C-4’)，76.9(C-5’)，61.0(C-6’)。对照文献[19]的数据，确定化合物为野蔷薇苷(Rosamultin)。

2.1.6 化合物6白色粉末ESI-MS m/z 671[M+Na]+；1H-NMR(400 MHz，CD3OD):δ5.48(1H，d，J=8.0 Hz，glc H-1)，5.34(1H，m，H-12)，1.41(3H，s，CH3-27)，1.21(3H，s，CH3-29)，1.20(3H，s，CH3-26)，0.91(3H，s，CH3-30)，0.80(3H，s，CH3-25)，0.74(3H，s，CH3-24);13C-NMR(100 MHz，CD3OD):δ53.5(C-1)，211.3(C-2)，82.5(C-3)，43.2(C-4)，53.1(C-5)，15.8(C-6)，32.4(C-7)，40.2(C-8)，46.9(C-9)，45.1(C-10)，23.2(C-11)，127.5(C-12)，138.5(C-13)，41.5(C-14)，28.3(C-15)，25.1(C-16)，48.1(C-17)，54.4(C-18)，72.2(C-19)，41.4(C-20)，25.6(C-21)，36.8(C-22)，28.1(C-23)，18.5(C-24)，15.3(C-25)，15.7(C-26)，23.2(C-27)，177.5(C-28)，25.8(C-29)，15.1(C-30)，94.4(C-1’)，72.5(C-2’)，77.2(C-3’)，69.7(C-4’)，76.9(C-5’)，61.0(C-6’)。对照文献[20]的数据，确定化合物为potentilanoside B。

2.1.7 化合物7无色针状结晶，易溶于氯仿，熔点(mp)温度138～140℃，与β-谷甾醇对照品比较，发现两者在薄层硅胶板上的比移值(Rf值)以及显色情况均相同，混合后熔点未下降，故鉴定为β-谷甾醇。

2.2 抗菌活性

从表1可知，化合物3～6对铜绿假单胞大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、肠炎沙门氏菌均有一定的抑菌能力，化合物4对大肠杆菌的抑制作用最为明显，最低抑菌浓度为31.3 μg/mL；4种化合物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度分别均为62.5 μg/mL和125 μg/mL；对肠炎沙门氏菌的抑制作用以化合物3最强，最低抑菌浓度为62.5 μg/mL。

表1 化合物3～6的最低抑菌浓度

3 小结

研究结果表明，贵州新鲜刺梨中含有6种三萜类化合物：蔷薇酸(Euscaphic acid，化合物1)、1α，2β，3β，19α-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic acid(化合物2)、2α，3α，19α-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid28-O-β-D-glucopyranoside(化合物3)、刺梨苷( kaiiichigeside F1，化合物4)、野蔷薇苷(Rosamultin，化合物5)、potentilanoside B(化合物6)；含有1种甾醇类：β-谷甾醇(化合物7)。其中，化合物2、化合物6为首次从刺梨中分离得到。比较化合物3～6的抗菌活性发现，化合物4抑制大肠杆菌的活性较强(MIC值为31.3 μg/mL)；化合物3抑制肠炎沙门氏菌的效果较其余化合物明显；4种化合物对金黄色葡萄球菌的抑制效果明显(MIC值均为62.5 μg/mL)。由此表明，这几种化合物可作为潜在的天然食品防腐剂加以开发。今后课题组将进一步研究评价几种化合物的抗真菌活性，以拓展其应用途径。

研究结果进一步明确了刺梨的化学物质基础，为深入探究刺梨发挥多种药理功效的具体有效成分、药理机制等提供了参考依据，也为开发营养、健康、绿色的刺梨系列功能产品提供了新的思路和方向。