丽江滇重楼和白芨根腐病病原菌鉴定

赵彩呈， 洪英娣， 刘 丽， 张珍荫， 熊正勇， 伍建榕*

(1.西南地区生物多样性保育国家林业局重点实验室，云南 昆明 650224； 2.西南林业大学 云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南 昆明 650224； 3.云南省玉龙纳西族自治县森林病虫防治检疫站，云南 丽江 674100； 4.云南省宁蒗县林业局，云南 宁蒗 674300)

滇重楼(Parispolyphyllavar.yunnanensis)也称七叶一枝花，属百合科，具有消肿止痛、清热解毒和抑菌的作用，可以用于医治咽喉肿痛、跌打损伤、止血祛痰等症状，临床上可有效止血，治疗外科炎症、神经性皮炎等。白芨(Bletillastriata)为兰科白芨属植物，花叶可供观赏，茎含大量具有特殊黏度特性的白芨胶，可应用于化妆品中，根则是珍贵的中药材原料，能够有止血凝血、消肿止痛等作用。随着滇重楼、白芨的集约化种植，品种退化和病虫害严重影响其产量和质量[1-6]。目前，对滇重楼的研究大多在分类、栽培技术、化学成分和药理作用等方面[7]，在病虫害防治方面特别是病害国内外相关报道较少[8-10]，而滇重楼和白芨根腐病在生产中发生普遍，是危害滇重楼和白芨的主要病害之一。因此，对滇重楼和白芨根腐病病原进行鉴定，以期为该病害的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 滇重楼和白芨样品采于丽江市玉龙县太安乡和宁蒗县甘海子村的重楼及白芨种植基地。

1.1.2 主要试剂真菌试剂盒为E.Z.N.ATMFungal DNA Kit(100)和D3390-01 (Omega Biotek)；ITS1、ITS4通用引物；PCR扩增混合液为2×Power Taq PCR Master Mix，BM2000 DNA Marker；DM0101(Biomed)；DDH2O；1×TAE缓冲液；琼脂糖；DNA stains。

1.1.3 仪器及工具 电泳仪、微波炉、凝胶成像仪、冷冻离心机、数显恒温水浴锅、分析天平、旋涡混合器、液氮罐(10 L)、PCR自动化系列分析仪、制冰机、基因枪等病原菌的分离和鉴定

1.1.4 培养基马铃薯琼胶培养基(PDA)，配方：洗净去皮马铃薯200 g，煮30 min，用纱布滤去马铃薯，加蒸馏水补足1 000 mL，加入葡萄糖或蔗糖20 g、琼胶20 g加热至完全融化后，于121℃高压灭菌20 min，冷却至55℃左右加入0.03 g/L链霉素，混合均匀后倒平板待用。

1.2 病原菌的分离与培养

1.2.1 根样处理将根部样品流水冲洗4 h，用毛刷轻轻刷去表面泥土，在超净工作台上将病根置于75%酒精浸泡30 s进行表面消毒后，置于0.1%升汞消毒3 min，无菌水冲洗数次后置于灭菌滤纸吸干，最后放于PDA培养基25oC下进行培养。

1.2.2 病原真菌的纯化病原菌在25℃黑暗条件下培养5～7 d，待菌丝从病根上长出后，将长出的菌丝挑至PDA培养基上继续培养5～7 d，获得纯化菌株，接种在试管PDA斜面上，4℃冰箱保存备用。

1.2.3 病原菌的形态学鉴定对纯化后的病原菌拍照、记录分离到的菌株数，参考MCLEAN等对菌落特征进行描述，测量菌落大小、记录菌落颜色、质地等形态特征。根据菌落形态特征，参考《真菌鉴定手册》和《真菌分类学》，对分离到的病原菌进行初步的分类、鉴定。

1.2.4 病原菌 ITS-分子序列鉴定

1) 菌株培养及采集。将-4℃条件下保存的纯化菌株转接于PDA培养基上活化，于25℃培养箱中避光培养3～7 d。待菌丝生长充足后于超净工作台上用无菌签刮下1～2 g菌丝放入1.5 mL离心管中，于-20℃冰箱中保存备用。

2) 菌株DNA的提取。利用真菌试剂盒提取分离菌的DNA：将装有菌丝的1.5 mL离心管置于液氮中，速冻后用研磨棒迅速将菌丝研磨至粉末状备用，DNA提取方法参照试剂盒内说明书。

3) PCR反应。反应体系25 μL：DNA 模板5 μL约50 ng，Mg2+浓度为1.5 mmol/L，dNTPs 浓度为0.2 mmol/L，引物稀释为5 pmol，Taq DNA聚合酶为0.75 U。反应程序： 94℃下预变性3 min；94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min， 30个循环；72℃延伸10 min。

4) PCR扩增产物的检测。架好清洗干净的制胶模板，将0.5 g琼脂糖粉、50 mL 1×TAE缓冲液倒入干净的三角瓶中，于微波炉中加热使琼脂糖融化，冷却至45℃左右时加0.4 μL核酸染料(4℃)并摇晃混匀。慢慢倒入制胶模板中，不应有气泡。放置20 min，待胶凝固后，将其取出并放入装有1×TAE缓冲液的电泳槽中。用基因枪分别将5 μL PCR样品、DNA Maker加入点样孔中，于100 V电压下电泳30 min。在凝胶成像系统下观察500～700 bp的基因片段长度，将PCR产物送往测序公司测序。

5) 菌株比对鉴定。序列测定结果采用NCBI进行比对，得到同源性99%及以上的序列，再利用ClustalX1.83、BioEdit、Sequence Alignment Editor、PAUP、Tree View等软件对所得序列进行分析，建造系统发育树。

2 结果与分析

2.1 根腐病病状

滇重楼从染病部位开始根茎逐渐腐烂，但在发病早期滇重楼病症表现不显著，后期地上部分叶片因根部吸收水分及养分能力减弱，边缘变黄焦枯，萎焉易拔起，最后整株萎蔫，根茎部腐烂变软。白芨染病从块茎处开始出现水渍状腐烂，后块根彻底变黑腐烂，地上部茎叶先表现叶尖枯黄叶片失绿，后出现大面积褐色枯斑枯死(图1)。

图1滇重楼(左)和白芨(右)根腐病地上部分症状

Fig.1 Aboveground symptom of root rot ofParispolyphyllavar.yunnanensis(left) andBletillastriata(right)

2.2 病原菌的形态特征及培养性状

从图2看出，分离菌(DB-R)菌体呈规则圆形，生长迅速，不易被污染，菌丝初期为白色丝状，后变为紫红色。

图2 DB-R培养 3 d(左)和7 d(右)后的性状

Fig.2 Morphological characteristics of DB-R after 3 days (left) and 7 days (right)

2.3 病原菌的分子鉴定

利用通用引物ITS1和ITS4扩增DB-R的rDNA-ITS序列，获得500～750 bp长度的DNA片段(图3)。将序列测定结果利用NCBI进行Blast比对，找到同源性达99%的序列(GenBank登录号为MK156762)，在构建的系统发育树中，DB-R与尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum(MK156762)相聚一群，且自举值达100%(图4)。因此，确定引起滇重楼和白芨根腐病的病原真菌为尖孢镰刀菌。

注：M为2 000 bp的DNA Maker，1为菌株DB-R。

Note: M， 2 000 bp DNA Marker; 1,strain DB-R.

图3菌株DB-R 的 rDNA-ITS基因序列 PCR产物电泳图谱

Fig.3 Electrophoretograms for PCR products of rDNA-ITS gene sequences of DB-R strain

图4基于 rDNA-ITS序列构建的菌株 DB-R系统发育树

Fig.4 Phylogenetic tree of DB-R strain constructed based on rDNA-ITS sequences

3 结论与讨论

尖孢镰刀菌可危害茄科、豆科、林果及花卉等100多种植物，寄主范围广泛，种内含多个寄主专化型，在致病性上具有丰富的遗传多样性[11-12]。虽然试验确定引起滇重楼和白芨根腐病的病原真菌是尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)，但该菌株是否是滇重楼、白芨专化型还需通过与其他相关植物进行对比接种试验。

传统真菌学分类以形态学特征为主要依据，并遵循柯赫氏法则进行病原真菌的鉴定。但仅以病原真菌形态特征为分类依据，外界环境条件的影响很大，有时也很难获得其有性无性孢子形态，甚至有些真菌不易或不形成繁殖器官，不仅不便于真菌的分类鉴定，而且不能充分反映出物种进化及种群间亲缘关系。rDNA-ITS介于18SrDNA和28SrDNA之间， ITS在真菌种间变异丰富，但在同种内不同真菌间高度保守，可以提供丰富的遗传信息，应用分子生物学方法鉴定真菌性病害已经成为一种重要手段[13-15]。研究结合传统真菌形态学和rDNA-ITS序列分析，鉴定出危害滇重楼和白芨根腐病的病原真菌。参阅植物病原真菌学的相关研究[16-18]，不仅对DB-R的形态学特征进行了比对，而且在构建的基于rDNA-ITS序列的系统树中，DB-R与尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum(MK156762) 自举值达100%的聚在一起，确定引起滇重楼和白芨根腐病的病原真菌为能够为尖孢镰刀菌。

滇重楼和白芨都是土生土长的药材，长期的自然选择，使得其适应于该产地环境及植物的病原日益增多，而通过人工驯化后，植物的抗性往往降低，加之不当的栽培管理技术，使得种植区病害发生严重，甚至绝收。滇重楼及白芨的经济价值主要为根部，尖刀镰孢菌的危害不但能直接造成根部腐烂，还影响地上部的生长发育，间接地对其根部膨大成长产生影响，以此造成恶性循坏，导致绝收，严重阻碍当地药材生产发展。对于滇重楼、白芨根腐病病原菌的确定，不但能够帮助寻求滇重楼和白芨根腐病病害有效的防治方法，并为后续生防菌农药制剂的生产及其他生物防治的选择提供基础资料，还为种植地的经济发展做出贡献。