疏肝通窍方对急性高眼压大鼠视网膜神经损害的干预作用及对低氧诱导因子-1α表达的影响*

薛思源 赵 静林成敏 庄 彦

（1.浙江省温州市中西医结合医院，浙江 温州 325000；2.温州医科大学附属第一医院，浙江温州 325000）

青光眼是视力丧失的常见原因，为不可逆转的致盲疾病，其发病与年龄、遗传等多因素有关，眼压升高与青光眼的发生发展密切升高，降低眼内压可有效防治疾病［1-2]。眼内压与房水的运输密切相关，眼内压过高或者持续时间过长，可造成视神经的损伤，甚至失明，高眼压状态下活性氧在视网膜蓄积，加重视网膜细胞损伤［3-4]。 低氧诱导因子-1α（HIF-1α）为缺氧环境下高度特异性核因子，可激活下游靶基因的表达，适应缺血缺氧环境，低氧环境时HIF-1α降解受到抑制，其蛋白水平急剧增加，引起系列细胞缺氧反应［5-6]。韩静等研究发现，急性高眼压大鼠视网膜HIF-1α表达水平降低，通过活血化瘀方干预后HIF-1α表达升高，发挥视网膜损伤保护作用［7]。中医药在青光眼性视神经损伤方面具有独特优势。疏肝通窍方为本院治疗青光眼的临床治疗的经验方，可显著改善患者的视力和视野，具有较好的临床疗效，但其作用机制尚不明确。本研究通过建立急性高眼压大鼠模型，研究疏肝通窍法对急性高眼压大鼠视网膜神经损害的保护作用，并从氧化应激和HIF-1α表达水平方面探讨其作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级Wistar大鼠60只，健康无眼疾，体质量（200±20） g，雌雄各半，鼠龄 8～10 周，北京维通利华实验动物技术有限公司 ［SCXK-（京）2017-0061]。在（23±2）℃环境中采用12 h昼夜节律饲养，自由地饮水与进食，适应环境饲养1周进行试验。实验动物及条件符合《实验动物管理条例》要求。

1.2 药物与试剂 疏肝通窍方（组成：柴胡10 g，葛根10 g，当归 10 g，郁金 10 g，石菖蒲 10 g，丹参 10 g，枸杞子10 g，防风10 g），由笔者所在医院药房提供，制成质量浓度1 g/mL的药液备用；倍诺喜滴眼液，参天株式会社生产，批号180217。水合氯醛，上海化学试剂供应站生产；多聚甲酸，北京全世金生物科技有限公司生产；中性树胶，中国上海戴洋仪器有限公司生产；TUNEL凋亡试剂盒和DAB显色试剂盒，由碧云天生物科技有限公司生产；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒，武汉华美生物工程有限公司生产；HIF-1α单抗，北京中同生物技术有限公司生产；引物合成，上海生物工程公司合成；Trizol提取试剂盒，由宝生物工程有限公司生产；二甲苯、乙醇等试剂均购于国药集团化学试剂有限公司；实验用水为超纯水。

1.3 实验仪器 手术显微镜和手术器械，由苏州视觉医疗设备公司生产；LDZ-2型低速离心机，由北京京立离心机有限公司生产；ELx800酶标仪，由美国伯腾仪器有限公司生产；Tono-pen-avia笔式眼压计，由美国Mentor公司生产；BX60显微镜，由日本Olympus Optical公司生产；数码医学图像分析系统，由麦克奥迪实业集团有限公司生产；全自动免疫染片机，美国DAKO公司生产；RT-PCR扩增分析系统，由美国罗氏公司生产。

1.4 分组与造模 60只Wistar大鼠随机分为对照组、模型组和干预组，每组20只。对照组正常饲养。将模型组和干预组采用前房灌注加压法制备急性高眼压大鼠模型，造模前测量眼压排除眼压异常大鼠，10%水合氯醛腹腔麻醉，俯卧位固定，氯霉素滴眼液冲左眼，倍诺喜滴眼液滴左眼表面麻醉，穿刺针头于左眼平行于瞳孔缘迅速推进，孔眼朝下并位于瞳孔区中央并固定，生理盐水瓶悬置于角膜顶点90 cm，打开输液器，保持输液器内液体不滴，90 min后瞳孔散大，眼前节轻度缺血，眼压大于21 mmHg且高眼压连续持续7 d以上为造模成功［8]，点氯霉素眼液预防感染。对照组仅做穿刺处理，不加压。

1.5 给药方法 造模后模型组、干预组给予4 mL疏肝通窍方药液灌胃，对照组和模型组给予同等剂量的生理盐水灌胃，每天1次，分别于第3日和第7日处死各组10只大鼠观察。

1.6 标本采集与检测 1）眼压测定：盐酸丙美卡因滴眼液表面麻醉后，Tono-pen-avia笔式眼压计连续测量眼压3次，取平均值。2）视网膜形态学：分别于第3日和第7日处死各组10只大鼠，取左眼，生理盐水清洗后，10%甲醛固定液固定48 h后，二甲苯脱脂，酒精脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，中性树胶封片，光镜下观察视网膜各层结构。3）视网膜细胞凋亡：将视网膜切成0.5 mm3小块，多聚甲醛磷酸固定，常规脱水、浸蜡、包埋、切片，蛋白酶K消化，PBS清洗，滴加TUNEL试剂盒反应液和复合液，DAB显色，苏木素复染并封片。显微镜下取5个视野观察，正常神经节细胞核呈蓝色，凋亡细胞核呈棕褐色，计算出细胞凋亡指数，凋亡指数=阳性细胞数/总细胞数×100%。 4）MDA、SOD 和GSH-Px测定：处死各组大鼠前，心脏取血，3 000 r/min离心20 min，取上清，采用ELISA测定血清MDA、SOD和GSH-Px水平，按照说明书操作。5）HIF-1α mRNA水平测定：分离完整视网膜，吸干表面水分，Trizol法提取视网膜总RNA，260 nm和280 nm波长检测提取的RNA 纯度，以 GAPDH（上游 5′-TTCTAGAGACAGCCG CATCT-3′，下游 5′-TGGTAACCAGGTGTCCGATA-3′）为内参，采用实时荧光定量PCR检测HIF-1α mRNA水平 （上游 5′-CCATTACCTGCCTCTGA AACTCC-3′，下游 5′-CAGAAGGACTTGCTGGCTGATC-3′），40 个循环，预变性 95℃ 30 s，变性95℃ 10 s，退火60℃30 s，延伸72℃ 30 s，延伸72℃ 5 min，测定每组HIF-1α mRNA 的 Ct值，计算相对表达量。 6）HIF-1α蛋白测定：视网膜石蜡切片脱蜡至水化，柠檬酸抗原修复，超纯水冲洗，50 μL 3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，PBS缓冲溶液洗涤，50 μL山羊血清封闭15 min，倾去剩余溶液，滴加HIF-1α多克隆一抗稀释液，4℃孵育过夜，PBS缓冲溶液洗涤，滴加二抗，室温孵育2 h，PBS缓冲溶液冲洗3次，DAB显色3 min，自来水充分冲洗，苏木精复染，封片，HIF-1α蛋白表达量积分光密度（IOD）表示。

1.7 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用t检验比较组内和组间差异。计数资料以n（%）表示，应用χ2检验。不符合正态分布采用秩和检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠造模前后眼压比较 见表1。造模前各组大鼠眼压水平比较，差别不大（P＞0.05）。造模后模型组眼压高于对照组同期，干预组眼压则低于模型组同期（均P＜0.05）。

表1 各组大鼠眼压水平比较（mmHg，±s）

表1 各组大鼠眼压水平比较（mmHg，±s）

与对照组同期比较，*P＜0.05；与模型组同期比较，△P＜0.05。下同

组 别 第3日 第7日对照组 20.26±1.24 20.39±1.32 n 造模前20 18.61±1.23模型组 30.17±1.62* 29.53±1.46*20 18.25±0.96干预组 20 18.44±1.02 26.41±1.89*△ 23.72±1.52*△

2.2 各组大鼠视网膜形态学观察 见图1。对照组视网膜组织染色均匀，结构完整清晰，神经节细胞排列规则。模型组视网膜组织水肿，随时间延长水肿加重，各层结构紊乱，神经节细胞排列疏松，数量减少，明显萎缩变薄。干预组视网膜肿胀减轻，神经节细胞数量较模型组增加，视网膜萎缩程度减轻。

图1 各组大鼠视网膜病理组织切片（HE染色，200倍）

2.3 各组大鼠视网膜细胞凋亡指数比较 见表2。造模前各组大鼠细胞凋亡指数比较，差别不大（P＞0.05）。造模后，模型组视网膜细胞凋亡指数高于对照组同期，干预组视网膜细胞凋亡指数低于模型组同期，但高于对照组同期（均P＜0.05）。

2.4 各组大鼠造模后第3日、第7日MDA、SOD和GSH-Px水平比较 见表3。模型组第3日、第7日血清MDA高于对照组，SOD和GSH-Px低于对照组。而干预组第3日、第7日血清MDA水平与模型组比较则降低，SOD和 GSH-Px则升高（P＜0.05）。

表2 各组大鼠视网膜细胞凋亡指数比较（%，±s）

表2 各组大鼠视网膜细胞凋亡指数比较（%，±s）

组 别 第3日 第7日对照组 4.26±1.32 4.52±1.41 n 造模前20 3.61±1.17模型组 53.17±6.27* 50.61±7.12*20 4.25±1.07干预组 20 4.19±1.14 32.08±7.13*△ 27.61±5.37*△

表3 各组大鼠血清MDA、SOD和GSH-Px水平比较（±s）

表3 各组大鼠血清MDA、SOD和GSH-Px水平比较（±s）

组 别 时 间 GSH-Px（ng/mL）对照组 第3日 183.14±21.37（n＝20） 第 7 日 185.27±22.38模型组 第3日 90.36±23.05*MDA（ng/mL） SOD（IU/mL）3.18±0.75 89.23±4.38 3.28±0.96 90.12±4.51 8.26±1.03* 67.12±5.23*（n＝20） 第 7 日 89.01±24.26*8.07±1.12* 65.37±5.42*干预组 第 3 日 6.67±1.32*△ 75.33±5.76*△ 129.64±25.06*△（n＝20） 第 7 日 4.29±1.37*△ 80.67±5.71*△ 136.75±24.12*△

2.5 各组大鼠造模后第3日、第7日HIF-1α mRNA水平比较 见表4。模型组第3日、第7日HIF-1α mRNA水平高于对照组，而干预组第3日、第7日HIF-1α mRNA水平则低于模型组同期，但高于对照组同期（均P＜0.05）。

表4 各组大鼠HIF-1α mRNA水平比较（±s）

表4 各组大鼠HIF-1α mRNA水平比较（±s）

组 别 第3日 第7日对照组 1.00±0.03 1.00±0.02 n 20模型组 2.97±0.12* 3.02±0.14*20干预组 20 1.61±0.09*△ 1.28±0.08*△

2.6 各组大鼠造模后第3日、第7日HIF-1α蛋白水平 见图2和表5。模型组第3日、第7日视网膜可见HIF-1α棕黄色颗粒表达，模型组第3日、第7日HIF-1α蛋白IOD值高于对照组，干预组第3日、第7日HIF-1α弱于模型组，第3日、第7日HIF-1α蛋白IOD值低于模型组（均P＜0.05）。

图2 各组视网膜HIF-1α蛋白免疫组化图（DAB染色，400倍）

表5 各组大鼠视网膜HIF-1α蛋白水平比较（IOD，±s）

表5 各组大鼠视网膜HIF-1α蛋白水平比较（IOD，±s）

组 别 第3日 第7日对照组 0.25±0.04 0.27±0.03 n 20模型组 1.73±0.14* 1.69±0.11*20干预组 20 1.01±0.10*△ 0.81±0.07*△

3 讨 论

青光眼视神经萎缩的发病机制与机械压迫和血管缺血有关。眼压作用于筛板直接压迫视神经纤维，导致细胞代谢受损，缺血缺氧及视神经纤维失去周围组织的保护，眼压升高进一步加重视网膜神经调节障碍［9]。视神经损害主要表现为中心视野的损害，随后出现管状视野，最终导致失明，是由视网膜神经节细胞损伤变性和凋亡引起，高眼压导致缺血缺氧，使视神经纤维轴浆流中断［10]。高眼压状态下，视网膜细胞内自由基，MDA的体内表达水平是脂质过氧化作用的指标，GSH-Px是酶促抗氧化剂，与细胞内外各种酶结合，对机体各组织器官造成损伤，自由基则会影响细胞的正常结构和功能，导致视网膜细胞损伤受，SOD可通过催化超氧化物阴离子，发挥清除自由基的作用［11-12]。HIF-1α为氧依赖转录激活因子，缺氧条件下活性增强，表达增多，激活血管形成、细胞凋亡等靶基因，在缺血缺氧过程中发挥重要作用［13]。研究表明，眼压升高后视网膜HIF-1α表达增加，视网膜损害与HIF-1α表达增多有关，轻度缺氧使HIF-1α表达增加，改善能量代谢和血管生成，为青光眼的发病机制及治疗靶点研究热点［14]。

中医药对青光眼视神经保护具有特有的优势，《灵枢·大惑论》曰 “五脏六腑之精气皆上注于目而为之精”，而“肝开窍于目”，眼与人体五脏六腑，尤其与肝的关系最为密切。中医认为青光眼肝气郁结，气郁无助血前行，眼部气血癖滞，脉道阻塞，治宜疏肝解郁、通奇明目。疏肝通窍方为本院治疗青光眼的临床治疗的经验方，方中柴胡疏肝解郁明目，对肝郁肾虚型外伤性视神经萎缩治疗作用显著，能有效提高患者视力；葛根和石菖蒲加强君药疏肝理气、通窍明目，葛根有缓解脑血管痉挛，舒张小动脉，改善眼底微循环，增加血液供应作用；石菖蒲《本草正义》指出其“使耳目聪明，九窍通利”，挥发油有血管扩张作用；当归、郁金、丹参为佐药，活血化癖，通络明目，当归活血通经、祛疲止痛，《审视瑶函》当归活血饮，用于治疗眼病胞轮振跳，抑制氧化反应和自由基反应等，促进脑血红蛋白表达的恢复，具有保护视网膜的作用；郁金还可助君药疏肝理气，可引药入血，增强疏肝止痛作用，有降血脂，抗真菌作用；丹参祛癖止痛、清心除烦、通血脉，对局部血液疲滞作用明显，调节微循环血流速度，增强细胞的抗缺血、缺氧能力。枸杞子明目益精、益肝补肾，抗衰老、抗氧化损伤和抗细胞凋亡的作用；防风祛风解痉、梳理肝脾、调畅气机，与活血化瘀药物配伍有增效作用［15-18]。疏肝通窍方诸药配伍，共奏疏肝解郁、通窍明目功效，可有效保护高眼压视网膜组织。

本研究发现，干预组眼压低于模型组，视网膜肿胀减轻，神经节细胞数量较模型组增加，视网膜萎缩程度减轻，视网膜细胞凋亡指数低于模型组，血清MDA水平降低，SOD和GSH-Px升高，干预组HIF-1α mRNA水平和蛋白IOD值低于模型组。这与疏肝通窍方中柴胡增强免疫功能，影响神经营养因子的表达，减少兴奋性氨基酸；葛根扩张冠状动脉，抗氧自由基及抗脂质过氧化，提高局部微血流量；石菖蒲减轻由兴奋性氨基酸引起的神经毒性作用，当归抑制神经炎症反应，增强抗氧化能力；郁金改善血液循环，清除自由基；丹参改善微循环，调节血管内皮细胞；枸杞子抗氧化损伤，提高SOD活性；防风改善视网膜血供，扩血管改善微循环等密切相关［19-20]。

综上所述，疏肝通窍方可保护急性高眼压大鼠视网膜组织，减轻损害程度，其机制可能与抑制机体氧化应激和降低视网膜HIF-1α表达有关。