植物乳杆菌WW对高脂血症大鼠体脂的影响

郭晶晶，乌日娜，安飞宇，李 洋，祝新媛，武俊瑞*

（沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866）

心血管疾病是导致人类死亡的主要原因之一，其造成的死亡人数占全球总死亡人数的29%左右[1-2]。胆固醇对几种生理功能至关重要，对某些激素和维生素的形成是必要的，是细胞膜和神经细胞的重要组成部分[3]。然而，血清胆固醇水平升高被广泛认为是动脉粥样硬化、冠心病和中风等心血管疾病的危险因素[4-6]。流行病学和临床研究表明：在胆固醇含量与心血管疾病之间存在着显著的正相关，血清胆固醇下降1%可将心血管疾病风险下降3%[7-9]。虽然胆固醇是人体组织细胞所不可缺少的重要物质，但摄入的食物也会影响血浆脂质水平，疾病管理的主要预防措施之一是通过饮食和药物治疗来控制血液胆固醇和甘油三酯水平，最显著的是通过使用他汀类药物[10-11]。其他预防措施包括低胆固醇低脂肪食物的摄入、高膳食纤维食物的摄入，或者含有益生菌食物的摄入，例如双歧杆菌、植物乳杆菌等[12-14]。国内外越来越多的研究表明补充益生菌可以改善脂质代谢，降低血清胆固醇含量[15-17]。

植物乳杆菌是公认的一种益生菌，存在于许多食品中，同时也存在于人体胃肠道中，对人体健康具有良好的促进作用[18]。植物乳杆菌具有很多生理功能，如增强机体免疫力、促进营养物质吸收、维持肠道内菌群平衡等，许多研究表明植物乳杆菌也具有降低血清胆固醇的作用[19-20]。Nguyen等[21]通过动物实验证实从婴儿肠道中分离出的植物乳杆菌PH04具有降胆固醇的功能。胡梦坤等[22]从泡菜中筛选出一株高效降胆固醇的植物乳杆菌LP1103，通过动物实验表明其在体内也有高效的降胆固醇作用。张健等[23]通过研究证实了植物乳杆菌L01对喂食高脂膳食的大鼠脂质代谢中的降胆固醇功效。Li Chuan等[24]也通过大鼠模型实验证明了植物乳杆菌NCU116的降胆固醇作用。

许多学者研究了来自发酵乳制品和泡菜等制品中的乳酸菌的降胆固醇特征，然而很少有关于传统发酵豆酱中乳酸菌的降胆固醇作用的研究，因此，本研究旨在评估从东北传统发酵豆酱中筛选出的植物乳杆菌WW在喂食高胆固醇饮食的大鼠中的益生特征和降胆固醇潜力。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

植物乳杆菌WW（L. plantarum WW），分离自东北自然发酵豆酱。

32 只5 周龄清洁级雄性SD大鼠，体质量约为120～135 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCXK（辽）2015-0001。

高脂饲料（基础饲料87.7%（质量分数，下同）、胆固醇2%、猪油10%、胆酸钠0.3%）购自辽宁长生生物技术股份有限公司。

MRS液体培养基为本实验室自制；15%脱脂乳培养基 内蒙古金德瑞贸易有限责任公司。

总胆固醇（totalcholesterol，TC）试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇（highdensity lipoprotein-cholesterol，HDL-C）试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇（lowdensity lipoprotein-cholesterol，LDL-C）试剂盒、甘油三酯（triglyceride，TG）试剂盒、总胆汁酸（total bile acid，TBA）试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）试剂盒、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）试剂盒 南京建成生物工程研究所。

二甲苯、无水乙醇、浓盐酸、硫酸铝、碘酸钠、柠檬酸 国药集团化学试剂有限公司；苏木精 北京索莱宝科技有限公司；曙红Y（醇溶） 生工生物工程股份有限公司。

1.2 仪器与设备

DZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；UV-4802紫外-可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；生物洁净工作台 苏州市华宇净化设备有限公司；5418R小型台式冷冻离心机德国Eppendorf公司；DNP-9080型生化培养箱、QH01-9030A电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏试验仪器有限公司；冷藏冷冻箱 青岛海尔股份有限公司；ELX-800酶标仪 美国BioTek公司；DH36001B电热恒温培养箱 天津泰斯特公司；H-2050R超速冷冻离心机湖南湘仪公司；RM2235石蜡切片机 德国Leica公司；DP73显微镜 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种的活化与菌悬液的制备

将L. plantarum WW活化3 代，以2%接种量接种于MRS培养基中，37 ℃培养12 h，将培养液6 000 r/min离心3 min，用无菌生理盐水洗涤2 次，收集菌体，用15%的无菌脱脂乳复溶成菌悬液，菌落计数，调整菌液浓度至1h1010CFU/mL，用于大鼠灌胃。

1.3.2 动物分组及饲养

3 2 只S D大鼠1 2 h亮暗循环饲养，室内温度20～22 ℃，相对湿度60～65%，保持动物房通风、透光和清洁卫生。实验前大鼠自由摄食饮水，适应性饲养一周后，将大鼠按照各组之间平均体质量无显著差异分为4 组：正常对照组饲喂基础饲料＋无菌水、高脂模型组饲喂高脂饲料＋无菌水、脱脂乳对照组饲喂高脂饲料＋无菌脱脂乳、菌液干预组饲喂高脂饲料＋菌悬液（1h1010CFU/mL），每组8 只。每只大鼠灌胃量为10 mL/kg mb，每天上午定时灌胃，连续灌胃12 周。

1.3.3 动物样品采集

每天记录各组大鼠的摄食量，每周记录体质量。收集各组大鼠最后3 d的粪便，－80 ℃保存，用于粪便指标的检测。12 周饲养结束后，称量体质量，禁食过夜，静脉取血，用于血清血脂的检测。解剖取肝脏、脾脏、肾脏和心脏，用冷的生理盐水冲洗干净后滤纸吸干水分，分别称质量，按式（1）计算脏器指数。

摘取腹部脂肪、肾周脂肪及附睾脂肪，分别称质量并按式（2）计算脂肪系数。

从大鼠肝脏最大肝叶中（同一部位）切取相同大小的组织块，放入质量分数10%甲醛溶液中固定24 h，进行HE组织染色。其余肝脏用液氮迅速冷冻，－80 ℃冰箱保存，并尽快进行后续实验。

1.3.4 样品指标测定

1.3.4.1 血清指标测定

将取得的血液样品于3 000 r/min离心15 min，小心吸取上层血清，按照试剂盒说明书要求测定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、TBA、MDA、ALT、AST水平。

1.3.4.2 肝脏指标测定

准确称取肝脏质量，按1∶9（m/V）的比例加入9 倍的生理盐水，冰浴条件下机械匀浆，2 500 r/min离心10 min，制备成质量分数10%的匀浆上清液。按照试剂盒说明书要求测定肝脏中TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT和AST水平。

1.3.4.3 肝脏组织HE染色

将肝脏组织进行脱水、石蜡包埋，切成厚5 μm的薄片，放在60 ℃温箱中2 h，烘干。将切片脱蜡至水后用苏木精和伊红染液进行染色，然后脱水、透明、封片，最后于显微镜下观察染色效果，于200 倍镜下拍照。

1.3.4.4 粪便指标测定

准确称取粪便质量，按1∶9（m/V）的比例加入生理盐水，冰浴条件下机械匀浆，2 500 r/min离心10 min，制备成质量分数10%的匀浆上清液。按照试剂盒说明书要求测定粪便中TC、TG和TBA水平。

1.4 数据统计分析

采用SPSS 17.0统计软件对各实验数据进行方差分析和显著性检验。P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 L. plantarum WW对大鼠体质量和摄食量的影响

在大鼠12 周饲养期间未出现异常体征，实验结束后大鼠体质量增加量、总摄食量的记录结果如表1所示。

表1 各组大鼠的体质量增加量、总摄食量（n＝8）Table1 Body mass gain and total food intake of rats in each group (n= 8)

在4 组大鼠12 周的饲养过程中，每组大鼠体征正常，没有死亡现象。由表1可知，4 组大鼠初始体质量没有显著差异，在12 周饲养结束后，相对于正常对照组，高脂模型组大鼠的最终体质量显著增加（P＜0.05），体质量增加量也显著升高（P＜0.05），总摄食量显著增加（P＜0.05），这说明高脂饮食能够引起大鼠体质量的增加，初步确定高脂模型构建成功；相对于高脂模型组和脱脂乳对照组，菌液干预组的大鼠总摄食量显著降低（P＜0.0 5），同时体质量增加量也有所降低（P＞0.05），这说明L. plantarum WW能够通过减少大鼠的摄食量来抑制体质量的增加。

2.2 L. plantarum WW对大鼠脏器指数和脂肪系数的影响

表2 各组大鼠的脏器指数、脂肪系数（n＝8）Table2 Indexes of organ and fat of rats in each group (n= 8)

从表2中脏器指数可以看出，4 组大鼠的心脏指数、肾脏指数和脾脏指数差异不显著（P＞0.05），这说明L. plantarum WW对大鼠的心脏、肾脏和脾脏无毒副作用。从肝脏指数情况来看，高脂模型组和脱脂乳对照组肝脏指数显著高于正常对照组和菌液干预组（P＜0.05），而且菌液干预组的肝脏指数略低于正常对照组，但差异不显著（P＞0.05），这说明高脂饮食引起了脂肪在肝脏的堆积，而L. plantarum WW能够有效地降低脂肪在肝脏的堆积，进而缓解肝脏的损伤。从脂肪系数来看，相对于正常对照组，高脂模型组和脱脂乳对照组大鼠的腹部脂肪系数、肾周脂肪系数和附睾脂肪系数显著升高（P＜0.05），而灌胃L. plantarum WW菌悬液后，腹部脂肪系数、肾周脂肪系数和附睾脂肪系数均显著降低（P＜0.05），说明L. plantarum WW能够有效降低高脂大鼠体内的脂肪量。

2.3 L. plantarum WW对大鼠肝脏组织病理形态学的影响

通过对各组大鼠肝脏组织进行HE染色来进一步确定L. plantarum WW对高脂饮食引起的肝脏脂肪堆积的改善作用。

图1 L. plantarum WW对大鼠肝脏组织病理形态学的影响（×200）Fig.1 Effect of L. plantarum WW on pathological morphology of liver tissue (× 200)

由图1可见，根据组织切片观察，正常饮食大鼠肝细胞呈索状排列，细胞质呈红色，细胞核位于细胞中央。然而，在高脂模型组和脱脂乳对照组大鼠的肝脏中观察到胞浆中有明显的空泡形成和增加的脂质沉积，其特征为圆形细胞，边缘核和脂肪空泡化。灌胃L. plantarum WW后减轻了大鼠肝组织中的脂质沉积和空泡化的程度，与正常饮食的大鼠肝脏类似，但未恢复到正常水平。因此进一步说明L. plantarum WW能够有效减少脂肪在肝脏的堆积，缓解高脂饮食引起的肝脏损伤。

2.4 L. plantarum WW对大鼠血清血脂水平的影响

表3 L. plantarum WW对大鼠血清血脂水平的影响（n＝8）Table3 Effect of L. plantarum WW on serum lipid levels in rats (n= 8)

从表3中可以看出，高脂饮食大鼠血清中的TC、TG、LDL-C浓度显著高于正常对照组（P＜0.05），说明高脂模型造模成功。与高脂模型组和脱脂乳对照组相比，菌液干预组血清中TC、TG、LDL-C的浓度显著降低（P＜0.05），相对于高脂模型组分别降低了28.92%、22.47%和28.99%，相对于脱脂乳对照组分别降低了26.73%、21.29%和26.87%，这说明L. plantarum WW能够有效降低高脂饮食大鼠的血清血脂水平。HDL-C主要功能是转运磷脂和胆固醇，是一种抗动脉粥样硬化的脂蛋白，能促进外周组织中胆固醇的消除，防止冠心病的发生[25]。从表3可以看出，菌液干预组血清中HDL-C的浓度显著高于高脂模型组和脱脂乳对照组（P＜0.05），说明L. plantarum WW能够帮助降低患动脉粥样硬化等心血管疾病的风险。

2.5 L. plantarum WW对大鼠血清MDA和TBA浓度的影响

图2 L. plantarum WW对大鼠血清MDA（A）和TBA（B）浓度的影响Fig.2 Effect of L. plantarum WW on MDA (A) and TBA (B) contents in serum

MDA是不饱和脂肪酸过氧化反应的终产物，血清MDA水平被认为是由胆固醇引起的氧化应激的表达，通过测定血清中MDA浓度来判断脂质过氧化的程度和氧自由基的含量，氧自由基含量高会增加心血管疾病的发生几率[26-27]。从图2A可以看出，与正常对照组相比，高脂模型组和脱脂乳对照组血清中MDA的浓度显著升高（P＜0.05），灌胃L. plantarum WW后血清中MDA浓度显著降低（P＜0.05），相对于高脂模型组和脱脂乳对照组分别降低了32.21%和37.83%，说明L. plantarum WW可以通过降低MDA浓度来缓解脂质过氧化程度。

TBA是胆固醇在肝脏分解代谢的最终产物，与胆固醇的吸收、代谢及调节有着密切的关系，血清TBA水平变化可敏感地反映肝脏功能[28]。从图2B可以看出，与正常对照组相比，高脂模型组和脱脂乳对照组血清中TBA的浓度显著升高（P＜0.05），灌胃L. plantarum WW后血清中TBA浓度显著降低（P＜0.05），相对于高脂模型组和脱脂乳对照组分别降低了22.67%和21.72%，接近于正常水平。说明L. plantarum WW能够有效降低高脂饮食引起的血清TBA浓度升高，从而减少肝脏实质性损伤。

2.6 L. plantarum WW对大鼠肝脏血脂各指标水平的影响

由表4可知，与正常对照组相比，高脂模型组和脱脂乳对照组肝脏TC、TG、LDL-C含量显著升高（P＜0.05），而在灌胃L. plantarum WW后，肝脏TC、TG、LDL-C水平显著降低（P＜0.05），相对于高脂模型组分别降低了31.32%、26.09%和16.36%，相对于脱脂乳对照组分别降低了23.31%、28.42%和20.69%，其中TC水平接近于正常值。从HDL-C水平来看，菌液干预组、高脂模型组和脱脂乳对照组显著低于正常对照组（P＜0.05），菌液干预组大鼠肝脏HDL-C含量高于高脂模型组和脱脂乳对照组，但差异不显著（P＞0.05）。以上结果表明L. plantarum WW能够有效降低高脂饮食引起肝脏中血脂水平的升高，进而对肝脏起到一定的保护作用。

表4 L. plantarum WW对大鼠肝脏血脂水平的影响（n＝8）Table4 Effect of L. plantarum WW on lipid levels in liver of rats (n= 8)

2.7 L. plantarum WW对大鼠血清和肝脏ALT和AST活力的影响

图3 L. plantarum WW对血清和肝脏ALT和AST活力的影响Fig.3 Effect of L. plantarum WW on ALT and AST activity in serum and liver

转氨酶是催化氨基酸和酮酸之间氨基转移的一类酶，其中ALT和AST是评价肝功能的重要指标，当肝脏组织受到损伤时，由于细胞膜通透性增加，肝细胞浆内的ALT和AST释放到血液中，导致肝脏和血清中两者水平有所升高[29-30]。从图3中可以看出，高脂模型组与脱脂乳对照组血清和肝脏中ALT和AST活力显著高于正常对照组（P＜0.05），菌液干预组血清和肝脏中ALT和AST活力显著低于高脂模型组和脱脂乳对照组（P＜0.05），相对于高脂模型组，血清中ALT和AST活力分别降低了28.65%和29.32%，肝脏中ALT和AST活力分别降低了26.62%和22.89%。结果表明L. plantarum WW能够通过有效降低高脂饮食引起的血清和肝脏中ALT和AST活力的升高来缓解肝损伤。

2.8 L. plantarum WW对大鼠粪便TC、TG和TBA含量的影响

表5 L. plantarum WW对大鼠粪便中TC、TG和TBA含量的影响（n＝8）Table5 Effect of L. plantarum WW on TC, TG and TBA levels in feces of rats (n= 8)

由表5可知，与正常对照组相比，高脂模型组和脱脂乳对照组粪便中TC、TG含量显著升高（P＜0.05），这说明高脂饮食中含量过高的胆固醇无法在体内被消化吸收，随粪便排出了体外。菌液干预组粪便中TC、TG含量相对高脂模型组和脱脂乳对照组显著升高（P＜0.05），分别比高脂模型组高17.02%和21.53%，说明L. plantarum WW能够促进大鼠体内胆固醇随粪便的排出。

TBA与胆固醇的吸收、代谢和调节有着密切的关系，促进胆汁酸在肠道的排泄是降低体内胆固醇代谢的主要途径[31]。从表5中可以看出，高脂饮食大鼠粪便中TBA含量显著高于正常对照组大鼠（P＜0.05），灌胃L. plantarum WW后粪便中TBA含量显著升高，与高脂模型组相比升高了27.00%，说明L. plantarum WW能有效促进大鼠体内TBA的排泄，从而降低血清中胆固醇的含量，减少心血管疾病的发生。

3 讨 论

高脂血症通常表现为血清TC、TG和LDL-C水平的升高，伴随着HDL-C水平降低，与心血管疾病密切相关[32]。众所周知，高脂饮食可增加血液中的TC、TG和LDL-C水平，导致动脉粥样硬化发展的风险增加，而高水平的HDL-C可降低心血管疾病的风险。此外，LDL-C被认为是血清脂质中最危险的因素，这是由于氧化型LDL-C向动脉壁渗透的增加导致了动脉粥样硬化斑块病变[33-34]。本研究通过饲喂高脂饮食来建立大鼠高脂模型，5 周龄SD大鼠饲喂高脂饲料12 周后，血清中TC、TG、LDL-C水平显著升高（P＜0.05），HDL-C含量显著降低（P＜0.05），表明高脂模型建立成功。L. plantarum WW灌胃12 周后显著降低了血清中TC、TG、LDL-C浓度（P＜0.05），并且提高了HDL-C浓度（P＜0.05），与高脂模型组相比血清TC、TG、LDL-C浓度分别降低了28.92%、22.47%和28.99%。丁盼盼等[35]研究发现高脂小鼠灌胃L. plantarum L-3 30 d后血清中TC、TG含量分别降低了31.3%和20.44%；在Bao Yan等[34]的研究中，以大鼠为模型，将L. plantarum P-8实验菌株灌胃大鼠4 周后发现，相对于高脂模型组，菌液组大鼠血清中TC、TG、LDL-C含量分别降低了53.83%、47.68%和39.91%；而在Nguyen等[21]的研究中发现给小鼠模型灌胃L. plantarum PH04 14 d后，小鼠血清中TC、TG水平分别只降低了7%和10%。本研究与已报道研究结果相似但存在一定差异，主要可能与菌株类型、饲养时间、实验动物、菌液灌胃量等相关。

炎症标志物浓度升高、肝脏中脂肪的积累和血清脂质水平的升高，可能导致胰岛素抵抗、血脂异常和心血管疾病，此外，肝脏中过量的脂肪堆积可能导致肝脏氧化应激和肝脏损伤[36]。从本研究中肝脏指数可以看出，菌液干预组显著低于高脂模型组和脱脂乳对照组（P＜0.05）；从肝脏组织病理形态学分析来看，灌胃L. plantarum WW后减轻了其肝组织中的脂质沉积和空泡化的程度，这与Li Chuan等[24]的研究结果类似。从肝脏血脂水平来看，在灌胃L. plantarum WW后，肝脏TC、TG、LDL-C水平显著降低（P＜0.05），相对于高脂模型组分别降低了31.32%、26.09%和16.36%，TC水平接近于正常值，该结果与Huang Ying等[37]的研究结果类似但也存在一定的差异。此外，菌液干预组血清和肝脏中ALT和AST的含量显著低于高脂模型组和脱脂乳对照组（P＜0.05），相对于高脂模型组，血清中ALT和AST活力分别降低了28.65%和29.32%，肝脏中ALT和AST活力分别降低了26.62%和22.89%。以上结果表明L. plantarum WW能够有效降低高脂饮食引起肝脏中血脂水平的升高，进而对肝脏起到一定的保护作用。

另一个值得注意的现象是灌胃L. plantarum WW后粪便中TC、TG和TBA含量显著升高（P＜0.05），与高脂模型组相比分别升高了17.02%、21.53%、27.00%，说明L. plantarum WW能有效增加大鼠体内TC、TG、TBA的排泄，从而降低血清中胆固醇的含量，减少心血管疾病的发生。

4 结 论

L. Plantarum WW能够抑制高脂饮食引起的体质量增加，降低脂肪在肝脏、腹部、肾周和附睾部位的堆积，显著降低肝脏和血清血脂水平以及ALT和AST水平，增加HDL-C含量，并且能够显著降低血清中MDA和TBA水平，增加粪便中TC、TG和TBA含量。以上结果表明L. Plantarum WW能够有效降低高脂饮食引起的体内血脂水平的升高以及脂肪在肝脏和体内的堆积，进一步有助于降低动脉粥样硬化等心血管疾病的患病率，并且对肝脏有一定的保护作用，为进一步深入研究和开发降胆固醇产品提供了有益菌株和理论依据，但该菌株降胆固醇具体是一种机制作用还是多种机制共同作用，还需要进一步深入研究验证。