金属离子对乳酸菌生物膜形成的影响及其机制研究进展

2019-06-04赵佳伟敖晓琳

食品科学 2019年9期

赵佳伟，敖晓琳*，赵珂

（四川农业大学食品学院，四川雅安 625014）

乳酸菌是对能利用乳糖或其他糖类转化为乳酸的一类革兰氏阳性兼性厌氧菌的总称[1]。乳酸菌是食品发酵工业常用菌种，作为发酵剂被广泛用于不同的发酵食品（如酸奶、泡菜、香肠等）中，对食品的风味及口感起到很大的改善作用。乳酸菌不仅在发酵食品中被广泛应用，其作为生理菌群对人体的健康也起着至关重要的作用。许多研究表明，乳酸菌对于一些疾病具有控制和预防作用。如乳杆菌和双歧杆菌可以改善阿尔茨海默病患者的认知、情绪功能。双歧杆菌还可以帮助小鼠黏液层生长[2-3]。Swami等[4]的研究还证实常见的益生菌（包括乳杆菌属、双歧杆菌属等）可以有效地降低糖尿病患者的空腹血糖、胰岛素水平，并且能改善胰岛素抵抗综合征。因此，乳酸菌功能及应用开发是目前研究的热点。

然而，在乳酸菌发酵食品的生产和贮藏过程中，通常会因为不良因素（如低酸、高温、其他食品成分的抑制）而出现乳酸菌活菌数量下降，甚至显著下降的情况，此时该产品再进入人体消化道，其中所含的乳酸菌若不能耐受胃酸及肠道环境，则最终所剩无几，不能发挥改善人体健康等功能。因此研究如何改善乳酸菌的环境耐受性，使其在食品生产、贮藏及进入人体后的活性得到保持对于生产出有益的乳酸菌发酵食品具有重要的意义。

目前国内外研究提高乳酸菌活性的方法主要有以下几种：通过离子凝胶等方法将乳酸菌进行微胶囊化，使其环境耐受性增强[5-6]；添加低聚糖促进乳酸菌生长；采用基因重组改良乳酸菌遗传特性以及使乳酸菌产生生物膜来抵抗外界的环境变化[7-8]等方法。其中，生物膜由菌体本身生物合成，而且其能有效提高乳酸菌的抗逆性，因此受到越来越多学者的关注。

1 生物膜

生物膜这一专有名词于1978年被提出，并很快被认可，也有其他学者将其翻译为生物被膜[9]。生物膜由细菌细胞、胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）和其他颗粒物的水合混合物所组成[10]，是一种可循环发展的系统，其形成被认为是通过一系列不连续的步骤发生的，包括细胞附着到载体表面、小菌落形成、微菌落成熟或形成蘑菇状结构[11]。然后由于外界环境变化，生物膜开始解聚，微生物逐渐从生物膜上脱落扩散，有的还能进入下一个生物膜结构的形成循环中[12]。

生物膜形成后显著提高了其对环境的耐受性。Kubota等[13]研究了形成生物膜之后的植物乳杆菌JCM 1149和浮游菌株在各种有机酸（即乙酸、柠檬酸、乳酸和苹果酸）、乙醇和次氯酸钠中的生长情况，结果发现生物膜中的细菌细胞在静止或对数期显示比浮游细胞具有更好的抗逆性。而且，生物膜中的细菌细胞即使在悬浮或细胞悬浮液被稀释后仍保持对乙酸的抗性。玛依诺·木图拉等[14]对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的生物膜进行了研究，发现乳酸菌混菌生物膜具有较高的抗性并能稳定地释放菌体。通过这些研究表明，生物膜的形成可以有效提高乳酸菌的抗逆性。生物膜的形成受到很多的因素影响，包括载体表面的粗糙程度、pH值、黏附力、基因的调控和金属离子等[15-17]。本文着重论述了金属离子对于乳酸菌生物膜形成的影响及其机制。

2 金属离子对于乳酸菌生物膜形成的影响及其机制

金属离子对于乳酸菌生物膜的形成具有显著的影响，很多学者对此进行了研究，结果表明Mn2＋、Fe3＋、Fe2＋、Mg2＋和Na＋在一定浓度下会对生物膜形成起到促进作用，Cu2＋、Cu＋、Al3＋、Ca2＋、Pb＋和Zn＋等金属离子则会对生物膜的形成起到抑制作用。目前研究较多的是锰离子、铁离子、铜离子和镁离子，而其他金属离子对于乳酸菌生物膜形成影响的研究还相对较少。下面将详细介绍常见的金属离子对于乳酸菌生物膜形成的影响及其机制。

2.1 锰离子对生物膜形成的影响

锰离子作为乳酸菌生长的促进因子，在乳酸菌生物膜形成的过程中是否起重要作用，基于此问题，许多学者就锰离子对乳酸菌生物膜的形成作用进行了研究。张立冬等[18]的研究结果表明，MRS培养基中添加锰离子后，L. paracasei、L. rhamnosus、L. reuteri和L. plantarum 4 株乳酸菌生物膜的形成表现出较显著的差异[18]。Nozaka等[19]的研究也显示，不仅乳酸菌生长受到锰离子的限制，对于一些混合生物膜的形成也受到锰离子的影响，添加10 μmol/L的硫酸锰后植物乳杆菌ML11-11生物膜的形成量显著增加。

Ibusquiza等[20]研究了单增李斯特菌和植物乳杆菌WCFS1混合生物膜的形成，在酸胁迫条件下，应激反应因子sigB促进了微生物的存活，在补充MnSO4后混合菌株的生物膜开始恢复。说明轻度的酸刺激会导致相关氧化应激产生，锰作为自由基清除剂和氧化应激中关键酶的辅助因子促进反应的开始。有研究表明，由于植物乳杆菌缺乏完整的电子传递链或克雷布斯（Krebs）循环，同时植物乳杆菌缺乏超氧化物歧化酶，所以需要积累高浓度的锰以清除超氧化物，并在发酵和有氧生长过程中将其转化为过氧化氢，来促进生物膜的形成[21]。Watanabe等[22]的研究同样表明，在高浓度锰离子条件下生长的细胞比用低浓度锰离子条件下生长的细胞对过氧化氢表现出更高的抗性。

在环境压力下，细菌的形态对于维持活性和代谢有着重要的作用[23]。在应激条件下，细菌会分泌EPS来保护细菌免受不利环境的威胁[24]。有学者表示，过量的锰胁迫（5 760 mg/L）下细胞呈现聚集效应，表明植物乳杆菌CCFM436能调节其形态以抵抗锰胁迫[25]。而且在不同的锰离子浓度下，植物乳杆菌CCFM436可以通过精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和赖氨酸来提高EPS的分泌，增加生物膜的稳定性[26]。有研究显示，在锰胁迫条件下锰转运蛋白调节剂（MntH和MntR）可以控制细胞间锰离子的浓度[27]。锰转运蛋白（MntH 1-3）可能主要负责将锰转运到细胞内，而锰转运蛋白（MntH 4和MntH 5）在高锰胁迫下将锰转运出细胞[28]。

由此可见，锰离子对乳酸菌生物膜的形成具有一定的促进作用。锰离子可以通过消除氧化应激促进生物膜的形成，提高EPS的分泌调节细胞形态增强生物膜稳定性，同时细胞间锰离子浓度受到锰转运蛋白的调节。可以通过添加锰离子来促进乳酸菌生物膜的形成，以及提高乳酸菌生物膜的稳定性。

2.2 铜离子对生物膜形成的影响

经研究证实，铜离子会抑制多种细菌的生长活性，同时对微生物生物膜形成也具有重要作用。胡学伟等[29]在研究Cu2＋对于生物膜及EPS的影响时发现，当Cu2＋质量浓度＜2 mg/L时，Cu2＋会抑制生物膜分泌EPS，当2 mg/L＜Cu2＋质量浓度＜5mg/L时，生物膜分泌EPS的量增加，当Cu2＋质量浓度＞5 mg/L，生物膜系统出现不稳定的现象；比较蛋白质/多糖发现，Cu2＋对生物膜的抑制主要是对生物膜上胞外多糖的抑制，而生物膜对Cu2＋的抵抗表现为分泌更多的EPS，EPS与Cu2＋浓度呈线性正相关。Mosier等[30]研究了干酪乳杆菌和巴斯德酵母生物膜对于Cu2＋的吸收，发现在HCl洗涤和生物膜再生长之后，Cu2＋结合活性增加约5 倍。Yilmaz等[31]在研究屎肠球菌对于Cu2＋的吸附时也发现了相似的结果，即在pH 6.0下生物吸附能力达到最大。这些结果表明在HCl洗涤过程中被占据的Cu2＋结合位点被释放，而且生物膜或底物（或两者）被HCl调节暴露了另外的结合位点，从而破坏了生物膜的空间结构的稳定性。

Cu2＋和Cu＋对于细菌生物膜都有一定的抑制和破坏作用，而且Cu＋的抑制作用更强[32]。根据Lee等[33]的研究显示，Cu2＋和羟胺可以生成Cu＋，Cu＋将氧气活化成过氧化氢，随后Cu＋与过氧化氢能够降解有机物质（蛋白质和多糖）的高活性氧化剂，从而破坏EPS。

通过相关研究结果可以看出，Cu2＋和Cu＋对于生物膜具有抑制形成和破坏作用，其中Cu2＋通过抑制生物膜分泌EPS来降低生物膜的稳定性，而Cu＋通过形成高活性氧化剂来降解EPS，破坏生物膜结构。但在一定浓度内生物膜对其具有一定的耐受性。

2.3 铁离子对生物膜形成的影响

铁离子作为许多细菌生长的促进因子，对生物膜的形成过程也起着重要的作用。Bruslik等[34]研究了铁参与鼠李糖乳酸菌生物膜形成的过程发现，在铁离子浓度达到1 000 μmol/L时生物膜的形成显著增加，并且添加乙二胺四乙酸（500～2 500 μmol/L）不影响细菌的生长，但当与FeCl3一起添加时生物膜的增长受到抑制，进一步表明铁离子对于鼠李糖乳杆菌生物膜形成具有促进作用。陈凯[35]的研究结果显示，铁离子通过直接影响微生物生理或间接影响EPS组分对生物膜的形成造成影响。2 mg/L Fe3＋有助于生物膜的形成，而16 mg/L Fe3＋明显抑制了生物膜的生长和活性，并且16 mg/L Fe3＋刺激了EPS的大量分泌；生物膜EPS组分结果进一步表明2 mg/L Fe3＋有利于溶解性EPS和松散附着型EPS的增加并促进微生物的聚集，而16 mg/L Fe3＋会刺激紧密黏附型EPS大量分泌，这为微生物提供了保护层；并且铁离子对EPS中蛋白质的üCONH—、多糖中的CüO及核酸中的磷酸基团产生显著影响，铁离子会与EPS各基团中的碳原子或氧原子产生架桥作用。

Banin[11]、Oliveira[36]和Morrissey[37]等分别研究了铁对铜绿假单胞菌和表皮葡萄球菌生物膜形成的影响，结果都表明铁离子主要作用于生物膜形成初期，仅通过被动扩散无法提供足够的铁用于生物膜的形成，需要铁载体ABC转运蛋白的参与，在没有足够的内源性铁的情况下，可以通过特定的铁响应ECF σ因子系统来获得柠檬酸铁或铁胺盐用于生物膜形成。同时还有研究指出，铁吸收调节因子（ferric uptake regulator，Fur）可以调节细胞内铁水平的基因表达[38]。此外王婧等研究了罗伊氏乳杆菌EPS对于铁离子的吸附表明，相比于Fe2＋，罗伊氏乳杆菌EPS更容易结合Fe3＋，这主要是由于Fe2＋的离子半径大于Fe3＋，能更好地克服空间位阻，其中胞外多糖中的OüH、COO－和CüOH作为主要作用基团参与铁离子的结合[39]。

从上述研究来看，铁离子对乳酸菌生物膜的形成初期具有促进作用，铁离子可以通过刺激EPS的分泌和产生架桥作用来提高生物膜稳定性。乳酸菌生物膜形成过程中对铁离子的吸收受到铁转运蛋白的调控，Fur可能对乳酸菌细胞内铁水平的基因表达产生影响。

2.4 其他金属离子对生物膜形成的影响

除了上述的几种金属离子外，还有一些金属离子对于生物膜的形成也有不同程度的影响。张立冬等[18]的研究表明L. rhamnosus、L. reuteri在缺乏镁离子的MRS培养基中，生物膜的形成受到显著抑制。赖信可[40]的研究表明，镁离子在低于24 mg/L时对生物膜的形成具有一定的促进作用，其主要影响挂膜期，对于进入到成熟期后影响基本不明显。这可能主要是由于镁离子作为一种结构离子，是生物体代谢过程必不可少的元素，并且是多种酶反应的辅助因子[41]；带正电荷的镁离子可以中和微生物细胞表面的负电荷，使细胞容易聚合[42]；镁离子可以与EPS中带负电的官能团结合，形成微生物间的桥接功能，保持生物膜结构的完整性[43]。而且在实验中发现30 mg/L的镁离子使生物膜的形成变慢。这可能是由于浓度过高带正电的镁离子使微生物细胞胶粒表面正电荷变得紧密，影响了微生物营养的摄入；镁离子还可以与溶液中的CO32－和CO2反应生成MgCO3，导致传质通道堵塞，影响生物膜的形成；过高浓度的镁离子还会影响交联静电相互作用，从而抑制生物膜的形成[44-45]。从上述研究来看，镁离子对于生物膜形成的影响时具有两面性的。在低于24 mg/L时镁离子对于生物膜的形成具有促进作用，而大于30 mg/L时则会产生抑制作用。可以通过将镁离子控制在合理浓度范围来促进生物膜的形成。

对于Na＋来说，一定浓度的钠离子可以促进生物膜的形成，张国丽等[12]的研究表明，在20 mg/mL＜Na＋质量浓度＜40 mg/mL时生物膜的形成量与其浓度成正比。这与徐文生等[46]研究双歧杆菌生物膜形成的结果类似，低浓度的Na＋可以促进生物膜的形成。任晓镤等[47]的研究结果也显示出，在质量分数6%的NaCl条件下，戊糖乳杆菌可以形成相对较强的生物膜。这是由于细菌受到高渗透压胁迫，或者其相关基因的表达受到影响而促进了生物膜的形成。Lim等[48]对金黄色葡萄球菌的研究表明，盐诱导生物膜形成受到rbf基因的调控。Valle等[49]研究显示渗透压可以补偿生物膜表型不稳定，使生物膜变得平滑。但是也有学者研究表明，0.3 mol/L的NaCl对于鼠李糖乳杆菌生物膜的形成有轻微的抑制作用[50]。这可能是由于鼠李糖乳杆菌作为肠道微生物耐盐性较差的缘故。

有研究表明，铝离子对于生物膜形成的初期有抑制作用，这可能是由于铝离子对于微生物生长有一定的毒害作用，但是铝离子对于生物膜的毒害是非急性且可逆的，到了生物膜形成的成长期和成熟期时抑制作用就会下降，主要是生物膜对铝离子产生了耐受性[51-52]。

王尧禹等[53]研究了氢氧化钙作用后粪肠球菌生物膜相关基因，包括明胶酶明胶酶E基因（gelE）、表面蛋白基因（esp）、胶质蛋白黏附素基因（ace）、细胞溶血素A基因（cylA）的表达情况，得出氢氧化钙作用生物膜可抑制粪肠球菌基因gelE、cylA、ace、esp的表达。从而抑制粪肠球菌生物膜的形成。

Gerbino等[54]研究了L. keir JCM818和L. keir CIDCA 8348两个菌株，发现相对原子质量较小的金属离子（Ni＋、Zn2＋）比相对原子质量大的金属离子（Pb＋）更容易进入生物膜内部。这是由于金属离子会对S层蛋白产生影响。S层蛋白是指是覆盖在细胞外壳最外层的结构，通过非共价键连接到肽聚糖层，由蛋白质组成，有排列大小相同的孔，可以使活细胞与金属离子进行交换。S层蛋白有大量的金属结合位点，低特异性，可以结合不同的金属[55]。S层蛋白与金属离子之间是通过金属与Asp和Glu的羧酸盐侧链发生配位反应[56]。金属离子会导致β-折叠含量的增加和α-螺旋含量的减少[57]。在L. keir中肽骨架中的氮原子不参与同金属离子的配位反应。而且较小的金属离子会更容易穿过L. keir JCM818的S层蛋白并干扰到细胞使其变得更加疏水。通过傅里叶变换红外光谱检测发现JCM5818的α-螺旋含量的减少和CIDCA8348的β-折叠含量的增加几乎与金属离子的半径呈线性关系。这就表明金属离子还可以影响生物膜的空间结构，从而破坏生物膜的稳定性，抑制生物膜的形成。

3 结语

综上，Mn2＋、Fe3＋、Mg2＋和Na＋在一定浓度下都可以对生物膜产生促进作用（表1）。Mn2＋主要是通过消除氧化应激，刺激分泌更多的EPS来促进生物膜的形成；在一定浓度内的Mg2＋可以促进初期生物膜的形成，而过高浓度则会导致传质通道堵塞，影响营养的摄入抑制生物膜形成。有研究表明一些金属二价阳离子对于对细菌的脂多糖有稳定作用，其与阴离子产生的静电相互作用也有助于细菌的聚集和黏附[58]。Fe3＋主要是促进EPS的分泌，产生架桥作用，提高基因的表达水平来提高生物膜的稳定性；Na＋则主要是在低浓度下促进相关基因的表达和补偿生物膜表型不稳定来促进生物膜的形成。

表1 金属离子对乳酸菌生物膜形成的促进作用Table1 Promotion effect of metal ions on biof i lm formation of Lactobacillus

然而Cu2＋、Cu＋、Al3＋、Ca2＋、Pb＋和Zn＋等金属离子会对生物膜的形成产生抑制（表2）。其中Cu2＋主要形成高氧化剂分解有机物质，还可以破坏生物膜的结构来影响生物膜；Ca2＋则通过影响相关基因的表达来抑制生物膜的形成；Al3＋通过影响微生物的活性来影响生物膜的形成；Pb＋、Zn＋等金属离子则主要通过影响S层蛋白进而影响生物膜的空间结构。