长链非编码RNA KCNQ1重叠转录物1对肺鳞癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响

任开明

(中国医科大学附属盛京医院 胸外科, 辽宁 沈阳, 110004)

在中国，肺癌的发病率和病死率均居恶性肿瘤的首位，而肺鳞癌的发病率约占肺癌的1/3以上。多数肺鳞癌患者在初诊时已是晚期，治疗效果不佳[1]。目前，肺鳞癌主要的治疗策略仍是手术切除辅助术后放射治疗和化学药物治疗。近年来，针对肺鳞癌的突破性的精准治疗，尤其是靶向治疗方面无明显进展，研究[2]肺鳞癌发生进展的分子机制，发现潜在的治疗靶点尤为重要。长链非编码RNA(lncRNA)一般是指大于200 nt的RNA, 位于细胞核内或胞浆中，不参与蛋白质编码功能，以RNA形式在表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等多种层面上调控下游的功能基因的表达水平，能够参与细胞增殖、细胞周期、细胞分化、细胞凋亡以及细胞自噬性死亡等调节，进而发挥其生物学作用[3]。LncRNA KCNQ1重叠转录物1(KCNQ1OT1)定位11p15.5, 属于lncRNA。研究[4]发现其在结肠、直肠癌中存在表达及功能异常，而其在肺鳞癌中的功能和分子机制迄今尚无深入的研究。本研究拟检测lncRNA KCNQ1OT1在肺鳞癌组织中的表达，并研究KCNQ1OT1对肺鳞癌NCI-H266细胞增殖、迁移和侵袭等细胞生物学表型的调节作用[5], 现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本与试剂

收集51例手术切除的肺鳞癌组织及相应的距肿瘤5 cm以上的癌旁组织标本，标本来源于2015年1月—2016年12 月中国医科大学附属盛京医院胸外科手术患者，其中男28例，女23例。所有标本经病理鉴定均诊断为肺鳞癌。NCI-H266细胞系购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。KCNQ1OT1 smart silencer (siRNA-KCNQ1OT1)由广州锐博公司合成。Real-time PCR基因检测分析试剂盒购自TaKaRa公司, PCR引物委托大连TaKaRa公司合成。脂质体转染试剂Lipofectamine 3000为Invitrogen公司产品, MTT试剂盒为碧云天公司产品, Transwell小室购自美国Corning公司，Matrigel胶购自美国Becton Dickinson公司。

1.2 实验方法

1.2.1 Real-time PCR: 待检测组织标本置于预冷的研钵中，加入液氮用研杵研磨成粉末，加入TRIZOL, 提取总RNA并逆转录成cDNA。两步法扩增KCNQ1OT1基因。KCNQ1OT1引物序列: Forward为5′-CTTTGCAGCAACCTCCTTGT -3′, Reverse为5′- TGGGGTGAGGGATCTGAA -3′。以GAPDH 基因为内参，根据实验所获Ct值对KCNQ1OT1进行相对定量分析，分析方法选用比较CT值法(2-ΔΔCT法)。

1.2.2 细胞转染: 收获处于对数生长期至60%～70%融合的NCI-H266细胞。应用Lipofectamine 3 000转染试剂，按说明操作分别将si-KCNQ1OT1及si-NC转染NCI-H266细胞。继续培养24 h后收集细胞进行相应检测。

1.2.3 细胞增殖活力检测: 空白对照组为未转染的NCI-H266细胞; 阴性对照组为转染si-NC的NCI-H266细胞; KCNQ1OT1组为转染si-KCNQ1OT1的NCI-H266细胞, MTT 法检测细胞增殖活力。

1.2.4 细胞划痕实验: 将各组细胞接种到六孔板上，培养细胞汇合至80%左右时，用1 mL的移液枪头在六孔板的中央迅速划出一条直线，吸走培养液, PBS洗2次，放回培养箱培养。连续观察2 d, 查看划痕的间距，并测量照相。

1.2.5 细胞侵袭实验: 用无血清的opti-MEM培养基配Matrigel胶，均匀铺在直径为6.5 mm、孔径为8.0 μm的Transwell小室内面备用。取24孔板，每孔含20%胎牛血清的F12K培养基，放上Transwell小室; 将各组细胞消化后加入不含血清的opti-MEM培养基分别均匀地铺在上室内培养。24 h后取出小室，清洗，上室面细胞擦涂净; 将小室放入多聚甲醛固定液中，细胞固定，放入结晶紫染料中染色、清洗。在倒置镜下观察细胞个数。

1.3 统计学方法

每组实验重复3次，应用SPSS 22.0统计软件对数据进行处理，计量资料统计结果以均值±标准差表示。2组间差异比较采用t检验。多组间差异比较应用单因素方差分析，再用LSD-t检验做两两比较。检验水准α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 KCNQ1OT1在肺鳞癌组织中的表达及其与临床病理参数的关系

Real-time PCR结果采用比较Ct值法分析进行相对定量，结果显示KCNQ1OT1在肺鳞癌组织中呈显著高表达，为癌旁正常组织中KCNQ1OT1表达量的346%, 差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。KCNQ1OT1的表达与多种肺鳞癌的临床病理参数相关，包括分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移情况以及TNM分期。随着肺鳞癌分化程度的降低、肿瘤体积的增大、TNM分期的增加以及淋巴结转移的出现，肺鳞癌中KCNQ1OT1的表达显著增高(P<0.01); KCNQ1OT1表达与性别、年龄等其他临床病理因素无相关性。见表1。

表1 KCNQ1OT表达与肺鳞癌患者临床病理参数的

与同一参数另一亚项比较, **P<0.01。

与癌旁组织比较, ∗P<0.05图1 51例肺鳞癌组织与相应癌旁正常肺组织中KCNQ1OT1的表达

2.2 沉默KCNQ1OT1基因对NCI-H266 细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响

Real-time PCR检测显示，与对照组细胞相比, si-KCNQ1OT1的转染能够显著下调NCI-H266细胞中KCNQ1OT1的表达(P<0.05), 沉默KCNQ1OT1能够显著抑制NCI-H266细胞的增殖活力、迁移能力、侵袭能力(P<0.05)。见图2。

3 讨 论

目前，越来越多的证据支持lncRNA在多种生物学进程中发挥重要作用，并参与了包括肿瘤在内的多种人类疾病的发生，而且lncRNA参与了几乎所有的生理和病理的细胞学特性，能够通过复杂的调节机制调节细胞的增殖、凋亡、迁移和自噬等生物学表型[6-9]。某些lncRNA已被证实在多种肿瘤中存在表达和功能异常，而且可以作为肿瘤相关基因参与肿瘤的发生、恶性进展、侵袭转移及化疗耐药等的调节[10-12]。KCNQ1OT1基因定位11p15.5, 属于lncRNA。KCNQ1OT1的转录本是KCNQ1基因的反义链，是一个非拼接lncRNA。KCNQ1OT1与染色质互相作用，通过表观遗传学机制调节多个靶基因的转录。KCNQ1OT1在肿瘤中的研究尚处于起步阶段。有研究[13-14]报道, KCNQ1OT1在结直肠癌中存在显著表达和功能异常。Wan J等[14]研究发现, KCNQ1OT1中的短串联重复序列(STR)多态性(rs35622507)与肝细胞癌的易感性相关。作者在lncRNA芯片筛查中发现, KCNQ1OT1在5例肺鳞癌组织中表达显著上调。而后，作者应用实时定量PCR检测了51例肺鳞癌组织，大样本组织表达检测证实了KCNQ1OT1在肺鳞癌中确实存在显著的表达上调，这与李静等[15]发现KCNQ1OT1在89例非小细胞肺癌中的表达水平明显增高相符。这初步证实KCNQ1OT1的表达异常可能与肺鳞癌的发生相关。本研究还发现, KCNQ1OT1的表达与多种肺鳞癌的临床病理参数相关。随着肺鳞癌肿瘤体积的增大、分化程度的降低、TNM分期的增加以及淋巴结转移的出现，肺鳞癌中KCNQ1OT1的表达明显增高，进一步提示KCNQ1OT1可能在肺鳞癌的进展和侵袭转移中发挥作用。

Control表示空白对照组, si-NC表示转染si-NC的NCI-H266细胞, si-KCNQ1OT1表示转染si-KCNQ1OT1的NCI-H266细胞。

A: 转染si-KCNQ1OT1显著降低NCI-H266细胞中KCNQ1OT1表达，且与control、si-NC比较, *P<0.05;

B: MTT法检测KCNQ1OT1表达沉默能抑制NCI-H266细胞的增殖活力，且与control、si-NC比较, *P<0.05;

C: KCNQ1OT1表达沉默能抑制NCI-H266细胞迁移能力; D: Transwell法检测KCNQ1OT1表达沉默能抑制NCI-H266细胞的侵袭能力，且与control、si-NC比较, *P<0.05。

图2 沉默KCNQ1OT1基因对NCI-H266细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响

KCNQ1OT1在肺鳞癌中的功能尚不清楚，亦无相关文献报道。作者应用RNA干扰技术沉默了肺鳞癌NCI-H266细胞中的KCNQ1OT1表达，并检测其表达沉默对NCI-H266细胞的增殖、凋亡及侵袭能力的影响。实验结果发现, KCNQ1OT1沉默能够显著抑制NCI-H266细胞的增殖活力以及迁移和侵袭能力。KCNQ1OT1沉默能够显著地抑制NCI-H266细胞的恶性生物学表型，证明KCNQ1OT1在肺鳞癌中发挥肿瘤促进作用，可能是肺鳞癌潜在的癌基因。

上述研究结果证实KCNQ1OT1的肿瘤促进作用，但其作用机制尚不清楚。近期有研究[16]报道, KCNQ1OT1能够促进印记基因SLC22A18的表达，而SLC22A18基因在非小细胞肺癌中表达上调[17], 沉默其表达能够抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭，并诱导细胞凋亡[15]。据此作者推测, KCNQ1OT1可能在肺鳞癌中通过促进SLC22A18基因的表达，进而参与肺鳞癌细胞的恶性生物学表达的调控中，这需要进一步地深入研究。