Myc可控表达的B细胞淋巴瘤小鼠模型的建立

韩琳琳, 李 斐, 李 艳, 吴 凡, 郁多男

(江苏省非编码RNA基础与临床转化重点实验室, 扬州大学, 江苏 扬州, 225001)

淋巴瘤是淋巴造血系统恶性肿瘤的总称，其死亡率较高，患者预后差，发病率呈上升趋势[1-2]。世界卫生组织将淋巴瘤分为霍奇金淋巴瘤(HL)与非霍奇金淋巴瘤(NHL)。国际淋巴瘤研究组织又将淋巴瘤分为B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和自然杀伤(NK)细胞淋巴瘤。目前, HL发病率较低，仅占10.9%, 且以每年3.0%～4.0%速率下降，而NHL发病率较高，占89.1%, 其中在儿童及青壮年比例较高。B细胞淋巴瘤是B细胞发生的实体肿瘤，约占恶性淋巴瘤的70.0%～80.0%[3], 其主要起源于淋巴组织生发中心的B细胞[4]。约40.0%的B细胞淋巴瘤存在染色体易位，这将导致肿瘤的发生、发展[5]。

Myc是一种癌基因，位于染色体8q24上，它编码蛋白C-Myc基因、L-Myc基因和N-Myc基因[6]。L-Myc作用较少, N-Myc可以在小鼠发育、细胞生长和分化中取代C-Myc功能，但N-Myc的表达具有组织限制性[7], 只有C-Myc基因在细胞的增殖、凋亡、蛋白质合成、DNA复制及促进血管形成等生物学过程中发挥着重要作用[8-9]。在伯基特淋巴瘤中, 90%以上出现Myc染色体的易位[11]。肿瘤的抑制是肿瘤抑制因子p53起着核心的作用[12], 而p53是一种转录因子，它可以通过调控其目标基因的表达来发挥作用[13-14]。然而, p53可以被一些应激信号激活，如有丝分裂的持续促进和DNA的损伤。同时，p53的激活可以导致细胞周期的停滞，进而导致细胞的凋亡[15]; p53也可以通过抑制与细胞周期无关的调节，如抑制肿瘤血管的生成[16]。大多肿瘤的形成与p53功能的失活有关，它的失活主要见于基因的突变与病毒癌蛋白的相互作用。

本研究利用Myc可控表达且p53失活的原理建立了B细胞淋巴瘤小鼠模型，利用敲入的可编码Myc和雌激素受体(ER)融合蛋白MycERTAM的等位基因，实现对Myc的“失活”与“激活”的调控[17], 现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞与动物

1.1.1 细胞培养: GP+E86包装细胞受赠于美国宾夕法尼亚大学AndreiThomas-Tikhonenko实验室, DMEM高糖, 10%胎牛血清, 10%双抗, 37 ℃, 5% CO2培养。

1.1.2 质粒的构建: 以MIGR1为逆转录病毒载体，成功构建MIGR1-MycER的逆转录病毒。细胞转染: 40 μL Lipofectamine 2000, 2 μg vsvg, 2 μg gagpol, 10 μg MIGR1-MycER, 混匀后室温静置10 min, 加入GP+E86细胞中，混匀后放入细胞培养箱过夜, 12 h后换液, 48 h后用新霉素(G418)筛选，细胞继续扩增培养。

1.1.3 小鼠皮下注射: p53敲除鼠和野生型C57BL/6小鼠杂交8代后，将小鼠脱臼处死，取小鼠四肢骨髓，用2 mL注射器吸取PBS冲洗出骨髓组织，与转染了MIGR1-MycER的GP+E86细胞混匀。选取6～8周C57BL/6同源小鼠10只分组行皮下注射，观察小鼠体内肿瘤生长情况。

1.2 药物

他莫昔芬粉末(Sigma, T5648)超声溶解于玉米油(Sigma, C8267)中, 10 mg/mL。每日腹腔注射1次，每只小鼠1 mg。

1.3 流式细胞术

将小鼠脱臼处死后，取出骨髓组织, PBS洗涤2次，由于MIGR1-MycER携带绿色荧光蛋白(GFP), 骨髓内的肿瘤细胞携有GFP荧光蛋白，可通过流式细胞术检测到Myc表达细胞。

2 结 果

2.1 Myc可调控的B细胞淋巴瘤小鼠模型的建立

将p53-null骨髓细胞与转染了MIGR1-MycER的GP+E86细胞混匀，经皮下注射到C57BL/6小鼠。由于此时Myc不能进入细胞核而处于“失活”状态，所以未见肿瘤形成。而在TAM腹腔注射后，Myc激活，进而促进了肿瘤的形成(图1A)。将小鼠肿瘤取出后，用70 μm尼龙网研磨，红细胞裂解液裂解红细胞后，用CD19抗体标记，流式检测结果证实该肿瘤来源于B细胞淋巴瘤(图1B)。

A: 小鼠模型实验设计; B: 肿瘤细胞流式检测结果

图1 Myc可调控B细胞淋巴瘤小鼠模型的建立

2.2 MycER淋巴瘤小鼠模型的皮下肿瘤生长速度具有他莫昔芬(TAM)依赖性

C57BL/6小鼠皮下注射2×106个MycER B淋巴瘤细胞后，小鼠随机分为3组: TAM+/+组，小鼠连续注射TAM, 肿瘤在第8天开始迅速变大; TAM+/-组，小鼠连续注射TAM, 到第8天停止TAM注射，肿瘤开始变小; 对照组小鼠未注射TAM, 则无肿瘤生长。见图2A。第14天将TAM+/+组与TAM+/-组小鼠脱臼处死，取出肿瘤分别称量, TAM+/+组小鼠肿瘤质量显著高于TAM+/-组(P<0.01)。见图2B。上述结果表明, TAM注射后可使Myc入核，促进肿瘤的发生、发展。

A: TAM+/+组、TAM+/-组及对照组小鼠肿瘤体积变化，其中TAM+/+组为连续注射TAM, TAM+/-组为连续

注射TAM至第8天，对照组未注射TAM; B: TAM+/+组、TAM+/-组小鼠肿瘤质量比较。与TAM+/-组比较, **P<0.01。

图2 Myc调控B细胞淋巴瘤生长的作用

2.3 MycER淋巴瘤小鼠模型的全身性肿瘤细胞生长速度具有TAM依赖性

C57BL/6小鼠随机分为2组，每组5只，将2×106个MycER细胞注射到鼠尾静脉。荧光显微镜下观察TAM+/+与TAM+/-淋巴瘤细胞的生长情况。连续2周注射TAM后(TAM+/+), 取出小鼠骨髓，用70 μm尼龙网研磨，PBS洗涤2次，倒置显微镜下可见大量绿色荧光细胞(图3A)，连续注射TAM到第8天停止TAM注射(TAM+/-)的小鼠骨髓几乎未见GFP阳性细胞(图3B), 流式细胞仪检测结果进一步验证此结果(图3C)。上述结果表明，腹腔注射TAM可以使Myc入核，促使淋巴瘤细胞生长，而停止注射TAM后, Myc无法入核，淋巴瘤细胞几乎停止生长。

A、B: 使用倒置荧光显微镜观察TAM+/+或TAM+/-的小鼠骨髓细胞，普通相差与绿色荧光是相同的观察视野;C: 流式细胞术分析TAM+/+或TAM+/-小鼠肿瘤细胞在骨髓中的比例

图3 TAM对MycER肿瘤细胞在骨髓中增殖的影响

除了观察骨髓中肿瘤细胞的生长是否依赖Myc作用之外，作者还通过组织学观察了小鼠主要脏器中肿瘤细胞的生长情况，结果发现腹腔持续注射TAM(TAM+/+)后小鼠主要脏器均有大量肿瘤细胞的生长，表现为肝、脾、淋巴结、肺、肾依次为()、()、()、(+)、(+), 其中()代表肿瘤细胞占据整个脏器的40%以上, ()代表肿瘤细胞占据整个脏器的30%以上, (+)代表肿瘤细胞占据整个脏器的10%以上。连续注射TAM到第8天后停止TAM注射(TAM+/-)小鼠主要脏器未观察到明显的肿瘤细胞存在。

2.4 MycER诱导的B细胞淋巴瘤可以不依赖于Myc而继续生长

为了更好的研究肿瘤生长动力学，作者将2×106个肿瘤细胞注射到C57BL/6小鼠皮下，并将其分为2组，每组3只小鼠, TAM+/+组小鼠进行TAM腹腔注射，肿瘤体积迅速增大; TAM+/-组小鼠连续腹腔注射TAM到第8天后停用，肿瘤体积逐渐变小，并停止生长，但3周后即使未注射TAM，肿瘤又重新生长。本实验重复至少3次，上述结果说明此种情况下，肿瘤的复发可以不依赖于Myc的作用。见图4。

TAM+/+组小鼠进行TAM腹腔注射,肿瘤体积迅速增大; TAM+/-组小鼠连续腹腔注射TAM到第8天后停用,肿瘤体积逐渐变小,但3周后即使未注射TAM, 肿瘤又重新生长。图4 MycER肿瘤细胞的生长可以不依赖于Myc的作用

2.5 TAM+/-组小鼠重新注射TAM后瘤体急剧生长

将2×106个肿瘤细胞注射到C57BL/6小鼠皮下，并将其分为3组，每组2只小鼠。TAM+/+组小鼠连续腹腔注射TAM, 肿瘤体积迅速增大; TAM+/-组小鼠于第8天停止腹腔注射TAM, 肿瘤逐渐变小，但22 d左右开始缓慢生长; TAM+/-/+组小鼠于TAM第8天停止注射，肿瘤体积也逐渐变小，但于第22天恢复腹腔注射TAM, 肿瘤体积急剧变大。本实验重复至少3次，上述结果说明MycER淋巴瘤细胞的生长尽管可以不依赖于Myc的作用，但Myc仍然可以使肿瘤的生长速度增加，而且与原发肿瘤的生长作用相比, Myc对复发瘤的作用更明显。见图5。

TAM+/+组小鼠连续腹腔注射TAM, 肿瘤体积迅速增大; TAM+/-组小鼠于第8天停止腹腔注射TAM, 肿瘤逐渐变小,但22 d左右开始缓慢生长; TAM+/-/+组小鼠于TAM第8天停止注射,肿瘤体积也逐渐变小,但于第22天恢复腹腔注射TAM, 肿瘤体积急剧变大。图5 TAM的不同注射情况对MycER肿瘤生长情况的影响

3 讨 论

Myc作为一种癌基因，它易位到免疫球蛋白增强子下游是伯基特淋巴瘤形成的标志性分子生物学特征[18]。Myc可以调控约15%的人类基因[19]。Myc的表达与多种调控机制密切相关，包括位于启动子区域基序的转录调节[20-21]。

本实验室建立了MycER/p53-null的B细胞淋巴瘤的小鼠模型，用TAM实现Myc“开”与“关”的两种状态的调控。作者将MycER逆转录病毒包装细胞与p53敲除小鼠骨髓细胞混合后注射到C57BL/6小鼠皮下，此时被MycER感染的骨髓细胞中的Myc不能入核，所以未见肿瘤出现。当腹腔持续注射TAM时, Myc入核，发挥促癌作用，肿瘤开始生长; 而当TAM撤离后肿瘤生长立即停止, 3～4周后肿瘤又开始重新生长。这些重新生长的肿瘤细胞(“逃逸者”)是不依赖于Myc的调控，但是再次给予TAM可导致肿瘤生长急剧加速，体积比原发肿瘤更大。这种再生长的肿瘤细胞虽然不依赖于Myc的生长，但是对Myc更加敏感。

目前，越来越多的科学家研究B细胞淋巴瘤的发病机制及治疗方法，但仍未见有效、可靠的治疗策略。虽然临床上应用抗CD20单克隆治疗B细胞淋巴瘤有一定的效果，但不是所有的患者对利妥昔单抗治疗敏感，因此迫切需要新的靶向治疗方法[22]。本课题成功建立了B淋巴瘤小鼠模型，此模型不仅具有人类伯基特淋巴瘤的分子与病理特征，还可自主调控Myc的活性，为临床研究B细胞淋巴瘤的相关机制及作用靶点提供了有效的模型。