乳腺癌易感基因1调控氧化损伤在神经退行性疾病中作用的研究进展

梁 辰，靳翠红*

(中国医科大学公共卫生学院卫生毒理学教研室，辽宁 沈阳 110122)

神经退行性疾病是一种异质性疾病，其特征性改变在于神经系统慢性进行性认知功能的丧失。大脑和脊髓的细胞由神经元组成，神经元功能包括：控制运动、处理感觉信息、作出决策。由于神经元细胞不会再生，所以损害不可逆转。典型的神经退行性疾病包括：阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease，AD)、帕金森氏病(Parkinson’s disease，PD)、亨廷顿氏病(Huntington’s disease，HD)等。随着生活水平的逐步提高，以及社会人口老龄化程度的不断加剧，AD、PD、HD患病人数逐年增多。神经退行性疾病的病情呈慢性不可逆性进行性加重，给社会和家庭带来了极大的负担。氧化应激导致的特定区域神经细胞功能紊乱是神经退行性疾病的重要发病机制。因此，阐明氧化损伤与神经退行性疾病的关系，及其可能的发病机制，对提高老年人的生命质量和寿命具有重要的理论和实际意义。

1 氧化损伤与神经退行性疾病

研究发现，神经退行性病变早期可检测到的事件之一就是DNA(主要是mtDNA)氧化性损伤，导致线粒体功能障碍，使神经元的氧化应激永久化，最终导致神经退行性病变。

由于机体脑组织耗氧量大、不饱和脂肪酸含量高、抗氧化酶含量低，导致脑组织极易受活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)攻击，引发氧化损伤[1]。研究证实，神经元DNA氧化损伤与认知缺陷密切相关，且在各种神经退行性疾病病理改变的早期发生[2]。当发生氧化损伤时，ROS产生过多，电子传递链(electron transport chain，ETC)复合物1、2、4的活性降低[3]。ETC功能障碍可能导致线粒体损伤。

AD是全球痴呆病中最常见且发病率最高的痴呆类型。有研究表明，AD患者脑中线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的氧化修饰有所增加，且在其皮质mtDNA中观察到8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-deoxyguanosine acid，8-OHdG)水平升高[4]。最近在AD患者脑中发现了由尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)，8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(OGG1)和DNA聚合酶活性降低引起显著的碱基切除修复(base excision repair，BER)功能障碍[5]。BER缺陷存在于AD患者的受累脑区以及未受影响的脑区，表明BER损伤是AD大脑的一般特征。

有大量文献支持线粒体功能障碍和氧化损伤在AD发病中的作用，即AD早期，大脑组织病理改变发生前已产生氧化损伤[6]。进一步的研究表明，mtDNA可能参与了AD的线粒体功能障碍。当患者mtDNA被转移到mtDNA缺陷细胞系时，由此产生的“胞质杂种”细胞重现了AD中脑和其他组织中所见的呼吸酶缺陷，表明这种缺陷至少部分是由mtDNA异常引起的[7]。

PD是第二常见的神经退行性疾病。ETC酶复合物I缺陷引起的线粒体功能障碍可能参与PD发病过程[8]。实际上，用于制作PD实验模型的线粒体毒素通常会破坏电子传输系统的能力，并以这种方式促进氧化应激[9]。PD患者黑质致密区(substantia nigra pars compacata，SN)的神经元细胞质8-OHdG免疫反应强烈，外周血淋巴细胞DNA氧化损伤(DNA单链断裂和氧化嘌呤碱基)及尿中8-OHdG水平更高。因此，认为线粒体损伤和细胞氧化状态失衡是PD发生和发展的重要因素[10]。

HD以常染色体显性方式遗传，致病原因是亨廷顿蛋白(Huntingtin，Htt)异常。HD是Htt基因的氨基末端编码区中胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤(CAG)三核苷酸重复序列异常扩增，导致相应蛋白中的N-末端聚谷氨酰胺表达异常[11]。HD动物模型研究发现3-硝基丙酸(3-nitropro pionic acid，3-NPA)腹腔注射能够引起线粒体复合物II的抑制，3-NPA是一种不可逆的琥珀酸脱氢酶抑制剂，这表明氧化应激可能在HD的发病中发挥重要作用[12]。

2 乳腺癌易感基因1

乳腺癌是影响女性健康的主要恶性肿瘤之一。乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1)是与乳腺癌发病相关的重要基因，是肿瘤抑制因子，参与维持基因组稳定性，其突变是造成大多数遗传性乳腺癌的原因。BRCA1突变发生乳腺癌的风险概率为80%[13]。

BRCA1基因位于染色体17q21.3，包含193 689个核苷酸，共有24个外显子。其中外显子11是核心外显子，编码超过整个蛋白质的60%[14]。BRCA1蛋白全长1 863个氨基酸，220 kD，是一种多结构域蛋白，有4个主要结构域：RING、BRCT、P300/CBP和卷曲螺旋(见图1)。其中RING结构域和BRCT结构域尤为重要。RING结构域与BRCA1相关环状蛋白(BRCA1 associated RING domain protein，BARD1)相互作用时，显示E3连接酶活性。RING结构域突变使其从BARD1脱离，E3连接酶活性消除，通常与癌症易感性相关。BRCT结构域是BRCA1羧基末端重复序列，其识别磷酸-SXXF基序中的磷酸化丝氨酸并结合3种蛋白，分别是带有pSPxF结构的磷酸化蛋白Abraxas，DNA解旋酶BRIP1和DNA修复酶CtIP。BRCT结构域与DNA损伤应答蛋白质相互作用，修复DNA损伤[15]。在RING和BRCT结构域发现了许多遗传性BRCA1突变，表明这些结构域对于BRCA1的功能至关重要。P300/CBP结构域可与P300、CREB相互作用，发挥转录调节活性。卷曲螺旋结构域在同源重组中起作用[16]。

图1 BRCA1蛋白的结构域

在功能方面，BRCA1是抑癌基因，参与细胞内多种代谢过程[17]。BRCA1可修复DNA损伤，在DNA损伤中，DNA双链断裂(DNA double-strand break，DSB)是最严重的损伤形式，会导致染色体重排、肿瘤发生和细胞死亡等[18]。DSB有2种修复途径：同源重组(homologous recombination，HR)和非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)。BRCA1是调控HR修复DSB的重要蛋白。相关研究证明除具有抑制恶性肿瘤发生的作用外，BRCA1蛋白在DNA损伤修复、细胞周期、基因转录调节、细胞凋亡等过程中发挥着重要的生物学功能[19]。

3 BRCA1调控氧化损伤的机制

3.1 BRCA1调控氧化损伤与基因组稳定性

基因组是指细胞内所有遗传信息，这种遗传信息以核苷酸序列形式存储。在机体内，基因组包括细胞核DNA(nuclear DNA，nDNA)和mtDNA，分别是细胞核和线粒体中的遗传物质。

mtDNA编码37个基因，其中大多数为ETC的必需蛋白[20]。mtDNA是独立于细胞核染色体外的基因组，由于以下3个原因：靠近氧化代谢部位——线粒体内膜，局部ROS高水平；缺乏保护性组蛋白；损伤修复途径不完善，主要依赖于BER途径，故mtDNA比nDNA对氧化剂更敏感，更易受到氧化损伤。因此，mtDNA积累的突变也远高于nDNA[21]。mtDNA突变或损伤会引起编码的呼吸链复合物活性下降，使得线粒体功能障碍，ATP生成减少，ROS产生增加。当不能及时修复mtDNA损伤时，则可能引起线粒体功能障碍和病理状态，进而导致机体衰老、肿瘤以及神经退行性疾病的发生。

基因组不稳定是肿瘤发生和神经退行性疾病一个重要的共同特征[22]。BRCA1与DNA损伤应答的相关研究发现，BRCA1在维持基因组完整性方面发挥重要作用。BRCA1在散发性乳腺癌和卵巢癌中表达降低或缺失，而且在非遗传性肿瘤中也起着肿瘤抑制基因的作用。BRCA1基因突变亦会增加前列腺癌和胰腺癌的患病风险[23]。在BRCA1缺陷(功能丧失或基因突变等)细胞中，存在DNA的损伤修复缺陷和基因组不稳定性现象。这种基因组的不稳定可能会引起基因组的永久致癌性或神经退行性改变[24]。

3.2 BRCA1调节DNA修复

生物体进化过程中形成了多种修复系统，对不同类型的损伤进行不同的修复，以保持基因组精确性和稳定性。研究认为，BRCA1参与调控3种DNA修复途径：BER、HR、NHEJ[25]。BRCA1通过刺激8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶OGG1、DNA糖基化酶NTH1、嘌呤核酸内切酶氧化还原因子1/嘌呤核酸内切酶1(REF1/APE1)等BER关键酶在人乳腺癌细胞MCF-7中的表达，从而促进BER途径[26]；OGG1、NTH1和REF1/APE1这3种酶都有助于BRCA1抵制由过氧化氢(H2O2)引起的氧化应激，H2O2能够促进这3种酶和BRCA1的表达。他们的研究结果确认了BRCA1可能调控DNA氧化损伤的一种新的机制[25]。

BRCA1也直接参与HR修复DSB。在应答DSB时，BRCA1会与受体相关蛋白80(receptor-associated protein 80，RAP80)形成BRCA1-RAP80复合物结合到DSB部位，促进DSB 5′端的切除，启动HR[27]。NHEJ不使用同源模板，而把几乎任何类型的DSB末端直接连接到一起，因此它可以发生于细胞周期任何阶段，在G1期占优势，研究发现在G1期BRCA1促进了NHEJ的发生[28]。当DSB发生时，BRCA1可以同ATM/ATR和传感器蛋白(MRN或Rpa)激活的磷酸化γ-H2AX形成复合物，并招募HR或NHEJ进行DNA的修复。如果损伤达到一定水平，则BRCA1充当ATM/ATR和Chk1/Chk2之间的适配器，在细胞周期中建立朝向检查点的级联，以便于DNA修复。如果损伤过重，细胞则发生凋亡[29]。

3.3 BRCA1调控转录因子Nrf2

BRCA1可诱导抗氧化剂应答基因的表达，保护细胞免受氧化应激的损害。多个研究提示BRCA1本身可以调节氧化应激：BRCA1缺失会增加细胞ROS水平，而BRCA1过度表达则抑制ROS的产生[26]。Nrf2-ARE是机体重要的抗氧化通路。Nrf2结合到靶基因启动子的ARE元件，诱导抗氧化酶基因的表达，从而抵抗化学致癌物以及修复ROS所致DNA损伤，进而保护正常细胞、抑制癌变，预防DNA氧化损伤的发生[30]。

研究发现BRCA1可促进Nrf2靶基因表达，且这种激活作用依赖于Nrf2启动子的存在，提示Nrf2在BRCA1信号通路下游，BRCA1通过调控Nrf2来促进抗氧化反应酶基因的转录表达，从而保护细胞免受ROS损害[31]。已有报道[32]发现化学防癌剂吲哚-3-甲醇(I3C)，及其代谢物二吲哚甲烷(DIM)可以促进BRCA1表达并激活Nrf2-ARE信号通路，但抑制BRCA1表达后，这种激活作用下降明显，说明DIM对Nrf2-ARE信号通路的激活依赖BRCA1的存在，故推测BRCA1可能介导Nrf2-ARE信号通路的激活。此外，BRCA1还可以抑制Nrf2的泛素化经降解[31]。

3.4 BRCA1调节细胞其他功能

BRCA1是一种多功能蛋白质，参与调控细胞周期、凋亡和各种转录途径以及DNA损伤信号传导和修复[34]。作为BRCAFanconi贫血症途径的一个组成部分，BRCA-Fanconi功能丧失导致细胞对DNA损伤剂的敏感性增加，细胞周期检查点缺陷和癌症易感性。BRCA1对直接修复和/或依赖其他补偿性修复DNA损伤必不可少[34]。BRCA1与BARD1一起发挥E3泛素连接酶功能，是BRCA1唯一已知的酶功能[35]。此外还有研究表明BRCA1单倍体不足导致参与细胞增殖和发育的43个基因表达改变，可能影响分化，从而使细胞更容易趋于恶化[36]。

4 BRCA1与神经系统功能

保持DNA完整性对于所有细胞和生物体均至关重要。DNA损伤和/或修复缺陷可能导致神经退行性疾病。Suberbielle等[37]发现，AD病人和人淀粉样前体蛋白(human amyloid precusor protein，hAPP)转基因小鼠大脑中BRCA1表达水平下调；β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)寡聚物处理可下调原代神经元中BRCA1的表达水平；小鼠海马DG区BRCA1沉默可增加DNA双链断裂、神经元固缩、突触可塑性受损、学习记忆缺陷，而APP/Aβ过表达可加重这些效应。此研究证实BRCA1与AD认知障碍密切相关。有研究发现铝暴露正常乳腺上皮MCF10A细胞可引起BRCA1 mRNA和蛋白的下降[38]。此外，AD中氧化性DNA损伤谱的证据提示BRCA1可能在神经退行性疾病的发病机制中发挥重要作用[39]。

研究发现，BRCA1对Aβ诱导的DNA双键断裂具有保护功能[37]。因死亡后细胞的降解和脑内细胞的复杂性限制了从分子层面阐明AD病理特征和神经功能障碍的因果关系，故有研究[40]应用AD患者死后大脑样本，分析其神经元特异性基因组DNA甲基化谱，确定了BRCA1启动子上有差异的低甲基化区域，而且发现BRCA1在AD脑中表达显著上调。同时，在体外细胞和小鼠模型中均发现，BRCA1在细胞质中定位错误会导致DNA双链断裂。Aβ负荷下BRCA1的功能障碍伴随着基因组完整性和突触可塑性下降。另外，模型小鼠脑中BRCA1启动子区呈低甲基化状态，提示BRCA1在AD中调控的一种表观遗传机制。上述研究均证实DNA完整性丧失是AD发病机制中的核心因素[40]。

有研究提出，观察到的神经元中活性磷酸化BRCA1的表达水平增强可能在AD细胞死亡信号传导中发挥重要作用，其过度激活可能先于最终的神经元丢失和BRCA1耗尽，研究还提出BRCA1上调在不同神经发育阶段具有不同的含义，在神经元前体，成熟健康神经元和成熟AD神经元中发挥不同的作用[41]。在神经元中，情况可能很特别。氧化应激状态下，神经元开启细胞周期的进展以便存活，进而发生有丝分裂突变和最终的细胞凋亡信号传导。由于BRCA1参与DNA修复，细胞周期暂停和细胞凋亡，随着AD和神经变性的进展，BRCA1的表达水平增加。实际上，BRCA1蛋白的表达可能在AD进展的早期被激活，即细胞周期的变化在疾病进展的早期发生。总之，BRCA1的功能障碍可能比Aβ等AD中已知的病理因素早得多[41]。

上述研究提示，BRCA1可以保护神经元基因组，维持神经元完整性和认知功能。下调BRCA1的表达可造成氧化应激而影响认知功能，进而引发神经退行性疾病。

5 小结

DNA氧化损伤是所有神经退行性疾病的早期病理事件。肿瘤抑制因子BRCA1在神经细胞中也可能发挥重要的调控作用，参与DNA氧化损伤修复及其他相关修复途径，与神经退行性疾病关系密切。研究BRCA1的调控作用有助于阐明神经退行性疾病的发病机制，并将为寻找潜在的神经系统退行性疾病的治疗和早期干预的靶点提供重要依据和线索。