miR-200b-3p和PAK2 mRNA在耐药卵巢癌组织中的表达及其临床意义

万树泉，魏丽军*，王福花，曾 勇

(1．山西医科大学第二临床医学院，山西 太原030001；2．山西医科大学附属肿瘤医院妇一科，山西 太原 030013；3．山西医科大学附属肿瘤医院分子生物室，山西 太原 030013)

卵巢癌是女性生殖系统恶性肿瘤之一，在全球的发病率和死亡率均仅次于宫颈癌[1]。由于缺乏早期症状和缺乏有效的早期筛查诊断方法，多数卵巢癌患者发现时已是晚期，5年生存率仅有20%~25%[2]。其主要治疗手段是肿瘤细胞减灭术加紫杉醇和铂类药物等化疗药的联合治疗，近些年尽管诊断和治疗技术的发展，死亡率仍无明显改善，其主要原因之一是化疗耐药。探寻耐药性卵巢癌新特异性的分子标志物，为其逆转化疗耐药开辟新途径提高治愈率已成为研究热点。Lee等[3]在秀丽隐杆线虫中发现能够按时序调控胚胎后期发育的第1个miRNA分子lin-4。后续系列研究证明了miRNA是一类重要的调控因子，可以通过结合靶mRNA的3′UTR导致mRNA降解或翻译抑制从而调节基因的表达，可参与细胞增殖、分化、凋亡、新陈代谢等生理过程[4]，也可参与恶性肿瘤的细胞增殖、侵袭、转移和化疗耐药/敏感等病理过程[5-6]。微小RNA(microRNA)的发现及其功能作用的揭示为上皮性卵巢癌多药耐药机制的研究带来了新的思路。

前期实验用miRNA基因芯片筛选出上皮浆液性卵巢癌耐药组织中miR-200b-3p表达上调，在此基础上选用目前常用的3个miRNA靶基因预测数据库：DIANA TOOLS、 miRTarBase、 TargetScanHuman miRNA进行miR-200b-3p靶基因预测并取交集，结合参考文献，初步选取PAK2为miR-200b-3p可能作用的靶基因，本实验采用实时定量PCR的方法检测与化疗耐药相关的差异表达miRNA-200b-3p，并阐明其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 组织标本

收集2015—2018年在山西省肿瘤医院就诊的50例上皮浆液性卵巢囊腺癌患者(25例化疗敏感和25例化疗耐药)为研究对象。并定义耐药组为处理组，敏感组为对照组。所有患者均符合以下纳入标准：①经过病理验证且之前未经过任何治疗(化疗、生物治疗和免疫治疗等)；②所有取材患者均已接受肿瘤细胞减灭术和术后3~6个周期的紫杉醇和顺铂(TP/TC)药物治疗；③临床资料完整者。根据2012年卵巢癌NCCN指南来鉴定化疗敏感和化疗耐药，肿瘤细胞减灭术后对初次化疗有明确反应，并达到临床完全缓解，停用化疗药6个月后复发者认为是化疗敏感，而卵巢癌术后初次化疗后6个月内复发认为是化疗耐药。卵巢癌复发指标：①CA125水平升高；②出现胸水和腹水；③体检发现肿块；④找不到原因的肠梗阻；⑤影像学发现肿块。如果满足以上两条或者两条以上指标，就可以认为卵巢癌复发。对怀疑可能复发的病人，有必要做CT、MRI甚至PET。术中收集新鲜的卵巢癌组织样本在离体后30 min内完全浸泡于RNA保存液中，并放入4℃冰箱过夜，随后倒去RNA保存液，置于-80℃冰箱中保存方便后续进行统一操作。这项研究得到了山西医科大学附属肿瘤医院支持及患者的知情同意。

1.2 主要试剂和仪器

RNAiso Plus，购于日本TaKaRa公司；the First Strand cDNA Synthesis Kit，无RNA酶水，均购于北京Tiangen®公司；SYBR®Select Master Mix，购于美国ABI公司；三氯甲烷/氯仿，购于天津福晨化学试剂公司；异丙醇，购于天津科密欧化学试剂公司；乙醇(75%、95%)，购于山西太原康久医药辅料福利公司；Nanodrop 2000/2000c，购于美国Themofisher Scientific公司；ViiA7 PCR仪，购于美国ABI公司；全自动样品冷冻研磨仪，购于上海净信实业有限公司；高速低温离心机，购于德国Eppendrof公司。

1.3 实时荧光定量PCR检测

取小块冻存的卵巢癌组织研磨、裂解、提取出总RNA。用Nanodrop仪检测总RNA浓度。严格按照ABI反转录试剂盒的说明书进行。将提取的总RNA反转录成cDNA，分别选取U6为内参，反应条件为：25℃、10 min，37℃、120 min，85℃、5 min，所得cDNA直接进行RT-PCR。严格按照miScript SYBR Green PCR试剂盒说明书制备20 μL qPCR反应体系，并使用美国ABI公司的ViiA7 PCR仪进行PCR扩增。miR-200b-3p引物序列：上游5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；下游5′-UAAUACUGCCUGGUAAUGAU-3′。PAK2基因引物序列：上游5′-CACCCGCAGTAGTGACAG AG-3′；下游 5′-GGGTCAATTACAGACCGTGTG-3′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；反应条件：95℃、5 min，95℃、45 s，60℃、30 s，40个循环，数据分析采用2-ΔΔCT法表示相对定量结果。△CT=CT，miRNA-CT，U6/p-actin，△△CT=△CT，耐药组-△CT，敏感组。表示miR-200b-3p、PAK2 mRNA在卵巢癌组织中的相对表达水平。

1.4 miR-200b-3p和PAK2 mRNA表达水平与上皮性浆液性卵巢癌患者的临床病理指标分析

分析miR-200b-3p、PAK2 mRNA表达水平和上皮浆液性卵巢癌患者年龄、临床分期、病理分化程度、淋巴结转移、血管侵袭和腹水中癌细胞检出情况的关系。

1.5 统计学方法

数据分析用 SPSS 22.0。采用 2-ΔΔCT法表示相对定量结果，计量资料采用xˉ±s表示，使用t检验进行比较。计数资料采用例数或百分比表示，采用χ2检验，α=0.05作为检验水准。Spearman法分析miR-200b-3p和PAK2 mRNA相对表达水平的相关性。

2 结果

2.1 卵巢癌患者基本信息表

敏感组和耐药组各有25名研究对象，敏感组平均年龄为(53.4±7.0)岁，耐药组平均年龄为(57.3±7.3)岁，两组间年龄差异无统计学意义(P=0.056)。耐药组淋巴结无转移的情况明显高于敏感组，差异具有统计学意义(P<0.01)。其余指标的差异均无统计学意义。

表1 敏感组和耐药组患者的基本资料

2.2 miR-200b-3p、PAK2mRNA和内参 U6、GAPDH的扩增曲线及熔解曲线

扩增曲线均呈现S型曲线，miR-200b-3p和内参U6的扩增趋势和扩增程度相似，两者曲线基本是平行移位，提示miR-200b-3p和内参U6的扩增效率基本一致(图1)；同样，PAK2 mRNA和内参GAPDH的扩增趋势和扩增程度相似，两者曲线基本是平行移位，PAK2 mRNA和内参GAPDH的扩增效率基本一致(图3)。熔解曲线都表现为单一的峰值，提示miR-200b-3p、PAK2 mRNA和内参U6、GAPDH的引物特异性好(图2、图4)。

图1 miR-200b-3p和内参U6的扩增曲线

图2 miR-200b-3p和内参U6熔解曲线

图3 PAK2 mRNA和内参GAPDH的扩增曲线

图4 PAK2 mRNA和内参GAPDH的熔解曲线

2.3 miR-200b-3p和PAK2 mRNA在卵巢浆液性囊腺癌组织中的表达量

荧光定量PCR(qPCR)结果显示，miR-200b-3p在25例化疗耐药卵巢浆液性囊腺癌组织的△CT为3.71±0.98，显著高于化疗敏感卵巢浆液性囊腺癌组织，耐药组相对表达量(2-ΔΔCT)是敏感组的15.78倍，差异具有统计学意义(P<0.05，表2，图1A)。耐药组卵巢癌组织PAK2的表达量显著低于敏感组卵巢癌，是敏感组表达的0.03，差异具有统计学意义(P<0.05，表2，图3、4)。

表2 不同组别miR-200b-3p和PAK2 mRNA水平的比较(n=25)

2.4 miR-200b-3p和PAK2 mRNA表达的相关性

miR-200b-3p和PAK2 mRNA的相对表达水平作Spearman相关分析，得相关系数r=-0.560，P<0.01，可见miR-200b-3p的相对表达量与PAK2 mRNA呈负相关。

2.5 卵巢癌组织中miR-200b-3p和PAK2 mRNA的表达与临床病理指标的关系

按照不同临床特征对研究对象进行分组，并用t检验比较两组之间miR-200b-3p和PAK2 mRNA平均相对表达量，检验水准α=0.05，有淋巴结转移的患者miR-200b-3p明显高于未转移的患者(P<0.01)，但是PAK2 mRNA的情况与之相反，有淋巴结转移的患者PAK2 mRNA表达量明显低于无淋巴结转移患者(P<0.01)。临床病理分期I-II和III-IV的miR-200b-3p和PAK2 mRNA平均相对表达量差别具有统计学意义，且I-II的miR-200b-3p高于III-IV的患者，PAK2 mRNA与之相反。其余分化程度、血管侵犯和癌细胞的分组差别均无统计学意义。结果提示miR-200b-3p和靶基因PAK2 mRNA的表达水平与病理分期、淋巴结转移具有显著的相关性，而与年龄、分化程度、有无血管侵犯以及是否发现癌细胞均无明显相关关系(P>0.05，表3)。

表3 卵巢癌患者miR-200b-3p和PAK2 mRNA相对表达量与临床病理指标之间的关系

3 讨论

上皮浆液性卵巢癌是一类妇科生殖系统恶性肿瘤，确诊晚、死亡率高、晚期患者5年生存率不足30%。肿瘤细胞减灭术联合化疗是治疗卵巢癌的重要治疗方式。化疗耐药是导致卵巢癌患者预后不良的主要原因。microRNA(miRNA)是一类长度约为21~25个核苷酸的非编码小分子RNA，具有高度保守性、组织特异性和时序性。miRNA的作用机制是降解靶mRNA或抑制其翻译，在转录后水平调控基因表达、细胞增殖分化以及肿瘤的发生发展[7]。在本实验中收集25例卵巢癌化疗耐药患者组织样本和25例卵巢癌化疗敏感患者组织样本，采用实时荧光定量PCR法检测miR-200b-3p及其靶基因PAK2的相对表达量，qPCR的结果显示miR-200b-3p在化疗耐药组中表达明显上调；耐药组卵巢癌组织PAK2的表达量显著低于敏感组卵巢癌患者。Spearman等级相关分析发现miR-200b-3p的相对表达量与PAK2 mRNA呈负相关，该实验结果提示miR-200b-3p在化疗耐药性卵巢癌中过表达，其机制可能是通过靶向调控PAK2参与调节化疗耐药和促进卵巢癌转移。文献报道miR-200b过表达促进肿瘤化疗耐药和转移，Meng等[8]首次提出miR-200b在胆管癌中过表达与化疗耐药相关，抑制miR-200b的表达可以提高胆管癌细胞对吉西他滨的敏感性。但是大量文献报道了miR-200b过表达可以增强化疗敏感性。如Yang等[9]发现，在对阿霉素具有抗性的MCF-7乳腺癌细胞中，miR-200b过表达可抑制上皮间质转化(EMT)和增加对多柔比星的敏感性。miR-200b在化疗耐药乳腺癌、骨肉瘤细胞中靶向调节FN1可增加化疗敏感性[10]。Brozovic等[11]研究发现在耐紫杉醇卵巢癌细胞OVCAR-3/TP和MES-OV/TP中，miR-200家族抑制EMT，产生了对卡铂的抗性，同时miR-200s的重新转染不能完全逆转EMT，在OVCAR-3/TP中恢复紫杉醇敏感性，但在MES-OV/TP中却没有改变。miR-200b失调与肿瘤化疗耐药之间的关系有以下几种可能的机制：①miR-200b可以通过影响上皮间充质转化参与肿瘤化疗耐药；②肿瘤干细胞具有促进肿瘤化疗耐药的作用，miR-200b可以通过干扰肿瘤干细胞的维持来参与肿瘤耐药，肿瘤干细胞具有促进肿瘤化疗耐药的作用；③miR-200b可以作为血管生成抑制剂降低血管内皮生长因子参与化疗耐药。在实验中，我们还发现miR-200b-3p的过表达与上皮性卵巢癌的临床分期，淋巴结转移有显著相关性，说明miR-200b-3p过表达可能与上皮性卵巢癌化疗耐药、迁移有关，大量文献研究表明miR-200s表达水平与化疗耐药有关，具有复杂性、细胞环境和药物依赖性。但是我们并未查到miR-200b-3p表达与卵巢癌化疗耐药具有相关性的文献，本实验为卵巢癌化疗耐药治疗提供新的方向，miR-200b-3p可能可以作为卵巢癌的潜在治疗靶点。

在生物信息学分析中[12]，我们利用多种miRNA靶基因预测软件预测到了307个靶基因，再进一步对预测到的靶基因行GO分析和KEGG Pathway分析，并结合药物代谢相关理论和化疗耐药相关文献分析靶基因。靶基因GO分析结果显示正调控含核酸碱基化合物代谢过程、正调控高分子代谢过程及细胞死亡可能与化疗耐药及药物代谢存在相关性。对预测到的靶基因行KEGG Pathway分析结果显示MAPK信号通路、ErbB信号通路可能参与化疗耐药发生机制。MAPK是丝裂原活化蛋白激酶，是一种参与调节细胞的生长、分化、应激、炎症等多种生理/病理效应的丝/苏氨酸蛋白激酶，具体信号传导有4种主要分支路线：ERK、JNK、p38MAPK、ERK5。Peng等[13]发现 miR-299-5p通过GOLPH3/MAPK/ERK轴之间抑制细胞凋亡，增强了胶质母细胞瘤细胞在体外和体内对替莫唑胺的耐药性。Zhou等[14]发现c-Jun激活可抑制食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)细胞生长并诱导细胞凋亡，从而抑制P-gp的表达，并通过激活p53信号传导途径增强p21表达，从而增加对顺铂的敏感性。ErbB蛋白属于跨膜酪氨酸激酶的表皮生长因子受体家族成员。该家族成员包括ErbB1(又称 为 EGFR/HER1)、 ErbB2(HER2)、 ErbB3(HER3)、ErbB4(HER4)。EGFR活化后可以通过激活PI3K/AKt下游信号通路参与肿瘤的增殖、分化、凋亡、转移等生物学行为[15-16]。综上所述，MAPK信号通路、ErbB信号通路均参与化疗耐药发生，两者均可作为后续机制研究的方向。同时靶基因PAK2均参与了这两条信号通路，因此，我们选择miR-200b-3p和它潜在的靶基因PAK2作为接下来的研究方向。

PAK2是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是PAKs家族成员之一，在各组织器官中广泛表达[17-18]，在运动、存活、有丝分裂和细胞凋亡等生理过程中起着重要作用。Li等[19]发现人类乳腺癌细胞系和人乳腺癌组织中PAK2表达较高，高表达的PAK2可以通过负调节降低caspase-7活性，从而抑制细胞凋亡，在人乳腺浸润性导管癌中介导化学治疗抗性。p21激活的激酶(PAKs)在具有获得性耐药性的转移性黑素瘤细胞中被激活，并且在化疗耐药中起关键作用[20]。在本实验中，我们发现PAK2 mRNA表达水平在耐药性卵巢癌组织中下调，miR-200b-3p和PAK2 mRNA的表达呈负相关。我们还发现低PAK2 mRNA表达与卵巢癌临床分期、淋巴结转移有显著的相关性，这说明低PAK2 mRNA表达水平与上皮性卵巢癌侵入和迁移有关。综合以上的实验结果和讨论，我们发现miR-200b-3p在化疗耐药卵巢癌组织中上调，可能通过诱导PAK2 mRNA下调参与上皮浆液性卵巢癌的化疗耐药，miR-200b-3p和PAK2与上皮浆液性卵巢癌化疗耐药、侵袭转移有潜在的关系。当然这是一个简单的推断。因此，我们要进一步去研究具体的调节机制。