氟达拉滨与TRAIL联用诱导肺癌细胞凋亡及其作用机制

王子依，张露露，孙震晓*，刘长振，*

(1．北京中医药大学生命科学学院，北京100029；2．中国中医科学院医学实验中心，中医药防治重大疾病基础研究北京重点实验室，北京 100700)

肺癌是当今世界最常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率和死亡率均呈明显增加的趋势[1]。氟达拉滨(Fludarabine)作为一种传统的抗肿瘤药物，不仅对多种肿瘤细胞有较强的抑制作用，还对正常细胞具有较强的毒性[2]。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)对多种肿瘤细胞有较强的特异增殖抑制作用，且对正常组织和细胞无明显毒性，但部分肿瘤细胞对其耐受，包括A549等细胞[3]。本研究通过检测Fludarabine在低浓度下与TRAIL联合处理对A549细胞凋亡的影响，以证实Fludarabine在低浓度下是否可以增加A549对TRAIL的敏感性，促进A549细胞的凋亡，以期为药物的联合处理提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

Fludarabine标准品购自Selleck公司。人肺癌细胞A549及人脐静脉内皮细胞HUVEC均为中国中医科学院医学实验中心免疫学实验室保存。RPMI-1640培养基、胰酶、PBS购自HyClone公司，ECM培养基购自Sciencell公司，胎牛血清购自Gibco公司，CCK-8试剂盒购自Dojindo公司，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自Biolegend公司。caspase-3、caspase-8、Bcl-2、Bcl-xL、Suvivin、JNK、p-JNK、p38、p-p38单克隆抗体均购自Abcam公司，抗兔IgG二抗、兔源GAPDH单克隆抗体均购自CST公司。

1.2 细胞培养

实验所用人肺癌细胞A549使用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基，人脐静脉内皮细胞HUVEC使用ECM培养基，两种细胞均在37℃、CO2体积分数为5%条件下进行常规培养，2~3 d传代1次。所有实验均在细胞对数生长期进行。

1.3 CCK-8法检测A549细胞及HUVEC细胞抑制率

实验分为对照组、Fludarabine组、TRAIL组和Fludarabine及TRAIL联合组，每组设3个复孔。取对数生长期A549细胞或HUVEC细胞分别接种于96孔板中(每孔5×103个细胞)，12 h后弃去培养液。对照组加入RPMI-1640完全培养基或ECM完全培养基(A549细胞使用RPMI-1640完全培养基，HUVEC细胞使用ECM完全培养基)100 μL；Fludarabine组分别加入含25或50 μmol/L Fludarabine的培养基100 μL，培养12 h后再次弃去培养液；TRAIL组加入含50 ng/mL TRAIL的培养基100 μL；Fludarabine和TRAIL联合组分别加入含25或50 μmol/L Fludarabine和50 ng/mL TRAIL的培养基100 μL。培养12 h后，每孔加10 μL CCK-8检测试剂，继续培养1～4 h，全自动酶标仪测定各孔D(450)值，按下式计算细胞抑制率。

细胞抑制率(%)=[D(450)对照组-D(450)实验组]/D(450)对照组×100%

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡情况

分组设置同前，取对数生长期的A549细胞，以每孔5×105个细胞铺于6孔板，培养12 h后弃去培养液，对照组加入RPMI-1640完全培养基，Fludarabine组加入含25 μmol/L Fludarabine的培养基，培养12 h后再次弃去培养液，TRAIL组加入含50 ng/mL TRAIL的培养基，Fludarabine+TRAIL联合组加入含25 μmol/L Fludarabine+50 ng/mL TRAIL的培养基。培养4 h后收集细胞，用0.5 mL结合液重悬细胞，加入5 μL AnnexinV-FITC及10μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)，混匀后室温避光反应15 min，用流式细胞仪(Accuri C6，BD)分析细胞凋亡率。以右下象限为早期凋亡细胞，其比率判定为凋亡率。

1.5 Western blot分析凋亡相关蛋白表达量

选取对数生长期细胞，接种于直径6 cm的细胞培养皿内(每皿1×106个细胞)。分组及处理方式同1.3。收集细胞，用30 μL细胞裂解液冰浴裂解30 min，10 000 r/min离心10 min收集上清。BCA法测定样品浓度后，经12%SDS-PAGE电泳分离，湿电转移至PVDF膜，室温下封闭1.5 h，分别加入caspase-3、caspase-8、Bcl-2、Bcl-xL、Suvivin、JNK、p-JNK、p38、p-p38和GAPDH一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入抗兔IgG二抗，室温孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，用ECL发光法获得蛋白条带，以GAPDH为内参分析目标蛋白的表达，采用Image Lab软件分析各蛋白表达量变化。

1.6 统计学方法

所有实验数据采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，对照组和加药组D(450)值或早期凋亡率差异采用t检验分析。α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 Fludarabine和TRAIL单独或联合处理对A549和HUVEC细胞增殖的影响

CCK-8实验结果见图1，可见25或50 μmol/L Fludarabine对A549细胞增殖无明显影响，50 ng/mL TRAIL对A549细胞的抑制率为6.2%。当25或50 μmol/L Fludarabine分别与50 ng/mL TRAIL联用后，对A549细胞的抑制率分别为30.9%和44.9%，显著高于Fludarabine或TRAIL单独处理(P<0.01)，说明Fludarabine能够使A549细胞对TRAIL的敏感性增加。Fludarabine和TRAIL单独或联合处理对HUVEC细胞增殖无明显影响，与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。

图1 Fludarabine和TRAIL单独或联合处理对A549和HUVEC细胞增殖的影响

2.2 Fludarabine和TRAIL单独或联合处理对A549细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果见图2，可见25 μmol/L Fludarabine和50 ng/mL TRAIL分别诱导A549细胞的凋亡率依次为11.1%和5.2%，二者联合处理后，细胞凋亡率为89.3%；而且进一步Western blot检测发现Fludarabine和TRAIL联合作用后A549细胞中procaspase-8和procaspase-3蛋白表达均下降，而cleaved caspase-8表达上升(图3)。说明Fludarabine联合TRAIL可增加肺癌细胞凋亡。

图2 Fludarabine和TRAIL单独或联合应用对A549细胞凋亡的影响

2.3 Fludarabine和TRAIL单独或联合用药对A549细胞有关信号通路的影响

Western blot结果见图4，25 μmol/L Fludarabine和50 ng/mL TRAIL联合处理引起A549细胞增殖蛋白Survivin和抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl水平降低，而引起JNK和p-p38水平升高。说明Fludarabine联合TRAIL可抑制肺癌细胞抗凋亡蛋白水平，而激活JNK和p38。

3 讨论

TRAIL是新发现的TNF超家族成员，能迅速诱导表达TRAIL特异受体的细胞发生凋亡。TRAIL可以选择性的杀伤肿瘤细胞，对正常细胞伤害较少[4-5]。然而，随着研究不断深入，人们发现部分肿瘤细胞对TRAIL并不敏感，这使得TRAIL在对这些肿瘤的治疗中受到极大的限制[6]。而TRAIL与其他传统抗肿瘤药物的联合处理极大的改善了这一情况。

图3 Western blot检测caspase-8和caspase-3蛋白表达

图4 Fludarabine和TRAIL单独或联合用药对A549细胞有关信号通路的影响

Fludarabine是一种对B-细胞慢性淋巴细胞白血病有显著疗效的抗肿瘤药物，副作用明显[2]。本研究发现Fludarabine低浓度下处理过的A549细胞再与TRAIL联合作用，可以使A549细胞对TRAIL的敏感性增加，A549细胞凋亡率明显上升，提示临床上Fludarabine与TRAIL联用可能会提高肺癌的治疗效果。

Caspase-8为死亡受体途径中重要成员之一，在细胞凋亡中发挥重要作用[7]。Fludarabine与TRAIL联用可使procaspase-8裂解为有活性的caspase-8，并能使procaspase-3裂解为有活性的caspase-3，有活性的caspase-3可以直接诱导细胞凋亡，这是诱导A549细胞凋亡的原因之一。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的重要成员，具有肿瘤特异性，作为负调控因素参与内源性和外源性凋亡途径，可直接抑制caspase-3的表达[8]。Fludarabine与TRAIL联用能够显著抑制A549细胞中Survivin的表达，激活caspase-3，说明Fludarabine与TRAIL联用可能通过抑制Survivin的表达促进caspase-3的激活，从而增加A549细胞的凋亡。Bcl-2、Bcl-xL为Bcl-2家族中抑制细胞凋亡的蛋白，Bcl-2和Bcl-xL在线粒体上形成离子通道，参与凋亡调节，并且可以诱导caspases的激活，本研究发现Fludarabine与TRAIL联合处理可以导致A549细胞中Bcl-2、Bcl-xL表达量降低，说明Fludarabine与TRAIL联用也可能通过抑制Bcl-2、Bcl-xL表达诱导A549细胞凋亡。JNK和p38为MAPKs重要成员，MAPKs信号转导通路存在于大多数细胞内，有研究表明MAPKs的激活可以增加细胞对TRAIL的敏感性[9]。我们的研究结果表明Fludarabine与TRAIL联合处理可以促进JNK和p38的激活，而JNK及p38的激活同样能够诱导caspases的激活，说明Fludarabine与TRAIL联用还可以通过MAPKs信号通路促进A549细胞的凋亡。

Fludarabine与TRAIL联用增强B-淋巴细胞性肿瘤细胞的杀伤作用已有研究，其作用机制为Fludarabine与TRAIL联用可以使DR5增高，从而导致细胞凋亡[10]，而本研究发现低浓度下Fludarabine增加A549细胞对TRAIL的敏感性的作用机制为通过对Bcl-2家族部分成员的作用及MAPKs的激活来增加A549细胞的凋亡率达到抑制细胞活力的效果，并且对正常细胞HUVEC无明显抑制作用，为进一步探索抗肿瘤药物与TRAIL联合处理增加TRAIL的抗肿瘤效果提供了新的思路。