基于TCGA数据库分析叉头盒蛋白FoxO1在前列腺癌中的表达及其作用

胡 婕，巢健茜*

(东南大学公共卫生学院医疗保险教研室，江苏南京 210009)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是男性中最常见的恶性肿瘤之一，在过去几十年中，前列腺癌的发病率一直在增加，其在美国男性癌症相关死亡的主要原因中排第3位[1-2]。近年来，我国男性前列腺癌发病率也呈逐渐上升趋势，并且发病年龄逐渐趋向年轻化，这对我国男性健康产生了严重威胁[3]。有研究显示，在65岁以上老年人中，约30%患有前列腺癌，很多患者是在中晚期才确诊，虽然大多数PCa患者预后相对较好，但治疗后复发或转移的PCa患者预后较差[4]。因此，鉴定与PCa相关的标志物将有助于正确的临床决策以及改善PCa患者的预后。

叉头盒(Fox)蛋白是转录因子家族成员，其特征在于存在高度保守的“叉头”或“翼状螺旋”DNA结构域。Fox家族中存在多个转录因子，均具有相似的DNA结构——含有110个氨基酸残基的保守序列[5-6]。最近的研究表明Fox家族参与恶性肿瘤转移过程，Fox蛋白具有双重作用，因为它可以与相同靶DNA序列的启动子区竞争性结合以影响转录，部分家族成员甚至既可以作为肿瘤抑制基因，同时在其他肿瘤中又对致癌基因有调节作用，介导肿瘤恶性生物学的各种表型[7-8]。已有研究发现，FoxA1、FoxK1和FoxJ1等是PCa复发与转移的潜在标志物[9-11]。然而，FoxO1在PCa中的作用尚未明确。

在本项研究中，我们旨在探讨FoxO1在前列腺组织中的表达，并分析FoxO1表达与PCa患者临床病理特征之间的关系。通过癌症基因组图谱(the cancer genome atlas，TCGA)公共数据集研究FoxO1对前列腺癌预后的影响，为进一步研究FoxO1在肿瘤发生发展中的作用机制提供线索和思路。

1 资料与方法

1.1 数据资料收集

通过cBioPortal网站(http://www.cbioportal.org)从TCGA数据集下载并预处理前列腺癌数据集的mRNA表达RNAseq或基因表达微阵列的数据以及临床病理学数据，进行病理相关性分析和预后分析。

1.2 利用GEPIA分析FoxO1基因表达水平

GEPIA网站(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)是由北京大学最新开发的交互式Web服务器，用于分析来自TCGA和GTEx项目的9 736个肿瘤样本和8 587个正常样本的RNA序列表达数据[12]。GEPIA网站提供了可定制的功能：比如肿瘤和正常组织的差异表达分析。因此我们在PCa(197例)及正常前列腺组织中(100例)分析了FoxO1基因的RNA表达水平，并且用箱形图来展示结果。

1.3 利用人类蛋白质表达图谱数据库分析FoxO1的蛋白表达

人类蛋白质表达图谱(The Human Protein Atlas，https://www.proteinatlas.org)是基于RNA测序分析和免疫组化分析的大型转录组和蛋白组数据库，是瑞典2003年发起的项目[13]，可用于组织和细胞系的免疫染色，也可用于分析正常组织和肿瘤组织蛋白的差异表达[14]。本研究引用网站中FoxO1免疫组化抗体(CAB022326)对正常前列腺组织和PCa组织进行免疫组化实验，分析FoxO1在正常前列腺组织和PCa组织中的蛋白表达。

1.4 统计学方法

对197例PCa样本建立患者临床资料库，将患者年龄、饮酒情况、TNM分期、肿瘤分化程度和FoxO1表达水平等指标量化赋值后进行统计学分析。临床病理相关资料分析采用卡方检验，对PCa组织中mRNA和蛋白水平的变化情况，建立PCa患者生存曲线，采用Log-rank检验比较不同FoxO1表达水平患者生存曲线的差异。单因素和多因素分析采用Cox回归模型，分析前列腺癌患者临床指标对前列腺癌患者预后的影响；根据表达谱数据，对样本的FoxO1表达进行由低到高排序，将高于中位数的值定义为高表达，低于中位数的值定义为低表达，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 FoxO1 mRNA在PCa组织中的表达

使用GEPIA平台分析FoxO1 mRNA表达水平的结果见图1。与正常前列腺组织相比，FoxO1 mRNA在PCa组织中表达显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

图1 FoxO1 mRNA在PCa和正常前列腺组织中的表达

2.2 FoxO1 mRNA表达与PCa临床病理指标的关系

在TCGA数据集中，FoxO1 mRNA的表达与TNM分期中T分期(肿瘤浸润深度)、M分期(远处转移)以及分化程度显著相关(P<0.05)，而与年龄、饮酒等情况无明显相关关系，见表1。

表1 FoxO1 mRNA表达与前列腺癌临床病理特征的相关性分析

2.3 FoxO1 mRNA表达与PCa患者预后的关系

本研究中共197例PCa患有相应的预后信息，应用GEPIA检测了FoxO1 mRNA与PCa患者预后的关系，结果显示，FoxO1 mRNA表达水平与预后存在相关关系(P<0.05)，FoxO1 mRNA表达水平越低，患者预后越差。在早期，FoxO1 mRNA低表达与高表达的PCa患者总生存率无显著差异(P>0.05)，后期随着时间推移，FoxO1 mRNA低表达者总生存率显著下降(图2A)。而FoxO1 mRNA低表达者无病生存率始终明显低于FoxO1 mRNA高表达的PCa患者(P<0.05，图2B)。以上结果显示，FoxO1可能是PCa的肿瘤抑制基因，其低表达与患者生存期缩短显著相关。运用Cox回归法分析患者生存状况的影响因素。结果表明年龄、T分期(肿瘤浸润深度)、分化程度、FoxO1 mRNA表达可作为PCa患者预后的独立影响因素，见表2。

2.4 FoxO1蛋白在PCa组织中的表达情况

利用Atlas蛋白(免疫组化)数据库，分析在正常前列腺组织和PCa组织中FoxO1蛋白的表达，免疫组化结果如图3所示，FoxO1蛋白在正常前列腺组织中染色程度较高，而在PCa中呈较低水平。说明FoxO1蛋白表达水平在PCa组织中较正常前列腺组织降低。

图2 PCa患者FoxO1 mRNA表达的生存期曲线

表2 影响前列腺癌患者预后的危险因素分析

3 讨论

前列腺癌(PCa)现已成为除膀胱癌、肾肿瘤外的第3大常见多发于男性泌尿生殖系统的恶性肿瘤，并且缺乏有效的治疗手段[15]。PCa具有发病隐匿，进展缓慢等特点，早期症状不明显，出现症状时诊断大多已到中晚期阶段。目前对于PCa的诊断主要通过前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)检测及经直肠超声引导下前列腺穿刺活检，其检测的灵敏度和特异度较差，存在筛查不足或过度诊断等问题。因此，寻找高灵敏度和特异度的生物标志物，提高PCa诊断准确性是当前PCa研究工作的当务之急。

FoxO1是叉头转录因子亚组的一个成员，已被证明在各种生理和病理过程中具有重要作用，包括DNA修复、细胞周期停滞、能量代谢、细胞凋亡、氧化压力和抵抗[16]。多项研究显示，FoxO1作为一种重要的转录因子可抑制多种肿瘤的发生并削弱几种实体癌的转移和侵袭能力。罗娟等[17]发现，FoxO1通过磷酸化、乙酰化等翻译后修饰调节靶基因的表达参与非小细胞肺癌细胞的凋亡、细胞周期阻滞、DNA损伤修复等生物学过程，从而抑制非小细胞肺癌的发生发展，因此，增强FoxO1表达或修复FoxO1活性是抑制非小细胞肺癌细胞增殖的重要因子。Fan等[18]的研究发现，miR-370能够调节乳腺癌细胞的迁移能力，而这个过程是通过FoxO1实现的，过表达miR-370后，FoxO1水平下降，细胞迁移能力增强。Zhao等[19]研究发现了FoxO1的另一种抑癌机制，在结肠癌中FoxO1被乙酰化并转移至细胞质中，胞质中的FoxO1能增强细胞的凋亡和自噬而起到抗癌作用。

本研究利用TCGA数据集，分析PCa中FoxO1的表达与PCa预后的关系。我们首先比较FoxO1在PCa组织和正常前列腺组织中的表达：在GEPIA平台中分析TCGA数据，发现FoxO1 mRNA水平在PCa中显著低表达；且FoxO1 mRNA的表达与肿瘤浸润深度和分化程度相关，即恶性程度越高的患者FoxO1 mRNA表达水平越低；生存分析结果显示FoxO1 mRNA表达和预后生存之间具有相关性，FoxO1 mRNA低表达患者的预后显著差于高表达患者；多因素Cox回归分析显示FoxO1可以作为判断PCa患者预后的独立影响因素，在Atlas蛋白数据库中从蛋白质表达水平进一步证实FoxO1在PCa中低表达，上述结果提示FoxO1基因在前列腺癌中有可能作为临床预后指标。

综上所述，本文通过对TCGA转录组测序数据库的挖掘，表明FoxO1可能成为PCa的诊断标志物以及治疗靶标。同时表明FoxO1基因在PCa中可能是一个潜在的抑癌基因，有必要进一步去研究该基因在PCa中的机制及功能，为FoxO1在肿瘤中的基础和临床研究提供线索和依据，亦为PCa的靶向治疗提供新思路。