ROCK1基因敲除对乳腺癌细胞系迁移及侵袭的影响

王晓杰，滕 宇，顾 勐，王子宇，赵晓婷，岳文涛*

(1．首都医科大学附属北京胸科医院/北京市结核病胸部肿瘤研究所细胞生物学研究室，北京 101149；2．首都医科大学附属北京妇产医院中心实验室，北京 100026)

乳腺癌(breast cancer)是全球最常见的女性肿瘤[1]，是女性癌症死亡的主要原因，约11%的乳腺癌发生在中国，而且近几十年来发病率及死亡率迅速上升[2]，其发生发展机制涉及诸多肿瘤相关基因的异常表达。事实上，在临床表现之前，肿瘤细胞转移性播散的最主要事件是细胞迁移，这也是肿瘤细胞转移过程的核心[3]。大多数乳腺癌患者死于多器官转移的晚期，是临床治疗失败的主要原因。Rho相关蛋白激酶(Rho-associated protein kinase，ROCK)大约在20年前首次被发现在细胞迁移中起作用[4]，它参与了几乎所有的迁移模式[5-6]。ROCK通过增强肿瘤细胞的侵袭性和运动性而显著促进转移[6-7]。因此Rho/ROCK通路通过调节肌动蛋白细胞骨架重组参与肿瘤发展进程。已有研究[8-9]报道，特定的ROCK抑制剂可以抑制肿瘤的生长和转移。ROCK1是小型G蛋白GTPase RhoA的下游效应物，通过肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)的磷酸化调节细胞的运动，从而促进应力纤维的形成，增强细胞的运动和迁移能力[10]。由此可见，ROCK1可能在肿瘤细胞迁移、侵袭中发挥作用。但在各种肿瘤中的作用和相关机制还有待明确。

本研究中，我们通过成簇规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9，CRISPR/Cas9)[11]技术在MCF-7乳腺癌细胞系中构建稳定的ROCK1基因敲除细胞模型，为后续鉴定ROCK1直接调控的靶基因，研究其参与乳腺癌细胞侵袭转移的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

Oligo引物(Generay Biotech)，2×Taq Plus Master Mix(Vazyme P212-03)，BsmB I(赛默飞)，T4 DNA 连接酶(Fermentas EL0016)，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和无内毒素质粒小提中量试剂盒均购自TIANGEN公司，胰蛋白胨和琼脂粉均购自OXOID公司，嘌呤霉素和琼脂糖购自Sigma公司，DTT二硫苏糖醇(Sangon D0281-5g)，胎牛血清和RPMI-1640培养基购自Gibco，引物、TOP10感受态、ROCK基因敲除慢病毒、Polybrene感染增强剂均购自Genechem公司，人乳腺癌细胞系MCF-7源自医学科学院基础所细胞资源中心，ROCK1兔源单抗和HRP标记的GAPDH单抗购自Abcam公司。

主要仪器包括：电泳仪(Tanon EPS-600)，Alpha凝胶成像分析系统(FluorChemTMSP)，摇床(华利达实验设备公司HI-9211K)，GHP-9080隔水式恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)，PCR仪(Applied Biosystems 2720 thermal)，高速离心机(Thermo cycler 17)，微型掌式离心机(GeneSci mini-6k)。

1.2 质粒构建

针对目的基因靶基因序列，设计向导RNA(small guide RNA，sgRNA)靶点序列，靶点序列分别为LVROCK1-sgRNA-1(ATCCGAATTCACTTCCGATT)、LVROCK1-sgRNA-2(CTTCATAGCATATACCTTCC)、LVROCK1-sgRNA-3(TTAGGATGGATTGGATGCTT)及对照病毒LV-NC的随机序列(CGCTTCCGCGGCCCGT TCAA)。载体两端BsmB I酶切位点序列如下：CACCGGAGACGCGTCTCT/GTTT，GTGGCCTCTGCG CAGAGACAAA/(斜线表示酶切产生的黏端，方向相同的斜线对应双链的互补碱基，下划线表示互补序列)，设计原理为在sgRNA两端加入BsmB I位点切割后产生的互补黏端，对GV392载体进行酶切，使其线性化，反应体系：GV392质粒(1 μg/μL)2 μL，10×酶切缓冲液 2 μL，DTT(20 mmol/μL)1 μL，BsmB I酶 1 μL，ddH2O补至20 μL；反应条件：37℃酶切3 h。由引物合成公司合成单DNA oligo(PAGE纯化)，线性化的载体DNA与退火的DNA双链进行连接，连入Lenti-CAS9-sgRNA-tag载体(Puromycin耐药标签)。反应体系及条件如下：线性化的载体DNA(50 ng/μL)2 μL，退火的双链DNA 0.5 μL，10×T4缓冲液1 μL，pEG4000 1 μL，T4 DNA 连接酶1 μL，ddH2O补足至10 μL；16℃反应3 h。将连接好的产物冰浴30 min后转化TOP10感受态细胞，吸取适量菌液均匀涂布在Amp抗性的LB固体培养基上，37℃恒温箱中倒置培养过夜，次日进行菌落PCR鉴定。菌落PCR得到阳性克隆后测序，从而得到序列正确的表达sgRNA的过表达慢病毒质粒。

1.3 重组质粒的鉴定

在超净工作台中，以无菌吸头挑取单个菌落至微型管中进行PCR鉴定，反应体系为：上游引物(10 μmol/L)0.5 μL，下游引物(10 μmol/L)0.5 μL，2×Taq Plus Master Mix 10 μL，模板菌落，ddH2O补足至20 μL。扩增循环反应条件为94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、90 s，共22个循环。上游引物序列采用质粒共有序列：5'-CCATGATTCCTTCATA TTTGC-3'，即 Primer(+)；下游引物序列采用sgRNA的oligo序列(5'-CGCGTGGATAACCGTATTAC-3')为反义链，即Primer(-)，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，将阳性菌落接种于200 μL含氨苄抗性的LB培养基中，37℃振荡培养2 h，取适量菌液进行测序，测序结果与设计的靶点序列进行比对分析。

1.4 慢病毒感染及细胞模型的筛选

人乳腺癌细胞系MCF-7培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中。感染前一天，消化MCF-7细胞，调整细胞浓度至3×104个/mL，每孔200 μL接种至96孔板。次日根据预实验确定合适的病毒复数(multiplicity of infection，MOI)值，用含有感染增强剂聚凝胺的细胞培养基稀释病毒，每孔加入100 μL病毒稀释液感染上述乳腺癌细胞，感染8 h后更换常规培养基，培养72 h后，换成含嘌呤霉素(3 μg/mL)的培养基继续培养48 h，对病毒感染细胞进行筛选，最终获得慢病毒感染且稳定敲除ROCK1基因的目的乳腺癌细胞株。

1.5 Western blot检测

将细胞株扩大培养，并分别收集稳定敲除ROCK1基因的乳腺癌细胞株、MCF-7亲本细胞以及阴性对照组细胞(LV-NC)，加入适量混匀的蛋白裂解液。蛋白裂解液的配制比例为每100万细胞内加入100 μL RIPA裂解液、1 μL cooktail、1 μL胆碱脂酶抑制剂PMSF以及二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol，DTT，稀释1 000倍使用)，充分震荡，12 000 r/min 4℃离心15 min，取上清液经BCA蛋白定量检测法测定样品浓度，按照与上样蛋白体积1∶4的比例加入含β-巯基乙醇的5×上样缓冲液，混匀后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。电泳结束，经恒流电泳转移、5%脱脂牛奶封闭、兔源一抗孵育、辣根过氧化物酶标记的二抗孵育、0.1%TBST洗膜、ECL化学发光等步骤，在Alpha凝胶成像分析系统(FluorChemTMSP)中曝光图像并分析结果。

1.6 划痕实验

将处于对数生长期的稳定敲除ROCK1基因的乳腺癌细胞株及对照组细胞株用胰酶消化后计数，接种于6孔板，接种数量以次日铺满6孔板一层为宜。接种24 h后，在6孔板中划痕，生理盐水冲洗3次，更换含有0.2%牛血清白蛋白(albumin from bovine serum，BSA)的DMEM培养基，分别于划痕后0、12、24 h观察细胞的迁移情况并拍照记录，实验重复3次。

1.7 Transwell实验

不铺胶：将处于对数期的稳定敲除ROCK1基因的乳腺癌细胞株及对照组细胞株接种于25 cm2的细胞培养瓶，24 h后换成含有0.2%BSA的DMEM培养基培养过夜，另将小室置于24孔板中，上室中加入100 μL含有0.2%BSA的DMEM培养基，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培养基平衡过夜。次日消化，计数细胞，调整细胞浓度为5×105个/mL，取100 μL加入上室。24 h后用2%龙胆紫将小室染色30 min，洗净，将小室的膜取下，封片拍照。

铺胶：将小室置于24孔板中，上室中加入50 μL含有0.2%BSA的DMEM培养基经1∶5稀释的基质胶，37℃温箱过夜。次日，在上室中加入100 μL含有0.2%BSA的DMEM培养基，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，水化30 min后加入100 μL细胞稀释液(5×105个/mL)，48 h后用2%龙胆紫将小室染色30 min，洗净，将小室的膜取下，封片拍照，其余步骤同上。

1.8 统计学分析

每项实验均至少独立重复3次；应用SPSS 16.0统计学软件对数据进行分析，图像分析所得相对灰度值以xˉ±s表示，两样本均数之间采用配对t检验进行比较。以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 ROCK1质粒的构建与鉴定

针对目的基因靶基因序列，设计sgRNA靶点序列，单链DNA oligo两端含酶切位点黏端，经退火处理形成双链DNA，连入Lenti-CAS9-sgRNA-tag载体(GV392、Puromycin药物筛选标记，图1A)。将连接好的产物使用TOP10感受态转化，菌落PCR得到阳性克隆后测序，从而得到序列正确、表达sgRNA的过表达慢病毒质粒，然后进行慢病毒的包装。LV-ROCK1-sgRNA-1(图 1B)、LV-ROCK1-sgRNA-2(图 1C)和 LVROCK1-sgRNA-3(图1D)的质粒测序结果正确。

2.2 稳定敲除乳腺癌细胞株中ROCK1的鉴定

为检验ROCK1基因敲除后，细胞株中ROCK1蛋白的表达情况，对LV-ROCK1-sgRNA-1/2/3和阴性对照(LV-NC)及未经感染的MCF-7细胞进行Western blot检测(图2)。在被LV-NC感染的对照组细胞及亲本细胞MCF-7中检测到特异性ROCK1蛋白条带，分子量约165 kD，在LV-ROCK1-sgRNA-1、LV-ROCK1-sgRNA-2感染的MCF-7细胞的对应位置可见到明显减弱的蛋白条带，而在LV-ROCK1-sgRNA-3感染的MCF-7细胞对应位置未见到明显蛋白条带，表明ROCK1敲除乳腺癌细胞模型构建成功。后续研究使用LV-ROCK1-sgRNA-3敲除ROCK1基因的细胞模型作为实验组；LV-NC感染的细胞作为对照组。

2.3 ROCK1敲除对MCF-7细胞迁移和侵袭能力的影响

划痕实验结果见图3。ROCK1敲除细胞株24 h划痕愈合度为(60.600±0.047)%，对照组细胞24 h划痕愈合度为(80.404±0.018)%，提示ROCK1敲除细胞株在24 h内划痕愈合面积较对照组明显降低，差异有统计学意义(P=0.003)。

图1 ROCK1质粒的构建与鉴定

图2 MCF-7细胞中敲除ROCK1的表达情况

Transwell结果见图4。结果显示在不铺胶情况下，实验组ROCK1敲除细胞株在24 h的迁移细胞数为(448.3±5.5)个，对照组的迁移细胞数为(271.3±5.0)个，提示ROCK1敲除细胞株在24 h内穿过小室底膜的细胞数与对照组相比明显降低，差异有统计学意义(P=0.001)。提示ROCK1敲除可明显抑制乳腺癌细胞MCF-7的迁移能力。

图3 划痕实验结果及分析

图4 Transwell实验结果及统计分析

在铺胶情况下，实验组中ROCK1敲除细胞株48 h内的迁移细胞数为(1.7±2.9)个，对照组的迁移细胞数为(298.3±5.7)个，提示ROCK1敲除细胞株在48 h时内穿过基质胶的细胞数较对照组明显降低，差异有统计学意义(P=0.001)。说明ROCK1敲除可明显抑制乳腺癌MCF-7细胞的侵袭能力。

3 讨论

乳腺癌患者的死亡率呈逐年上升的态势，肿瘤转移是大多数癌症患者死亡的主要原因[12]。肿瘤细胞的侵袭与转移是肿瘤转移过程的核心环节。小GTPase Rho家族通过调节细胞形态、生长和运动的功能在肿瘤的侵袭与转移过程中起着关键作用。ROCK1作为小型GTPase Rho家族主要的下游效应物，是激活Rho的主要介体，也是促进乳腺癌进展过程的重要因素[13-17]。Bottino等[14]用免疫组化的方法对乳腺癌肿瘤碎片中的ROCK1进行染色，结果发现有淋巴结转移的肿瘤组织中ROCK1蛋白含量远高于无淋巴结转移者，ROCK1蛋白的表达量与临床分期及有无远处转移也密切相关。除乳腺癌外，Vigil等[15]的研究表明，ROCK1作为非小细胞肺癌侵袭及转移的重要因素，可以作为治疗非小细胞肺癌的重要靶点。Sahai等[16]研究表明Rho GTPases调节细胞骨架和细胞迁移，在肿瘤中过表达，ROCK1也是其他癌症[17]细胞运动/侵袭的关键因素。

本研究利用CRISPR/Cas9技术，应用乳腺癌细胞株MCF-7构建ROCK1敲除细胞模型，通过DNA测序和Western blot证实ROCK1基因敲除细胞模型构建成功，进一步通过细胞表型实验研究ROCK1敲除细胞模型对乳腺癌细胞侵袭和迁移能力的影响。在用Western blot验证细胞模型是否构建成功的结果中(图2)，被LV-ROCK1-sgRNA-1或LV-ROCK1-sgRNA-2感染的MCF-7细胞仍存在减弱的蛋白条带，这表示插入的干扰序列未能完全抑制ROCK1蛋白的表达。在LV-ROCK1-sgRNA-3感染的MCF-7细胞的对应位置未见到明显蛋白条带，表明ROCK1敲除乳腺癌细胞模型构建成功。在划痕实验以及Transwell实验中，与LV-NC对照组相比，被LV-ROCK1-sgRNA-3感染的细胞在侵袭及转移方面的能力显著降低。

综上所述，区别于其他应用抑制剂抑制ROCK1作用的研究实验，本研究用Cas9的方法敲除了ROCK1基因，探究ROCK1基因的敲除对乳腺癌细胞侵袭转移能力的影响。通过Transwell实验和划痕实验，本研究发现相较于对照组，ROCK1基因敲除的细胞株迁移和侵袭能力明显减弱，ROCK1基因的失活突变可以抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力，实验结果与其他研究的观点相符，说明ROCK1在乳腺癌的侵袭和转移中发挥重要作用，为后续鉴定ROCK1直接调控的靶基因，研究其参与乳腺癌细胞侵袭转移的分子机制建立了稳定的细胞模型。