单独使用川穹嗪和联用维生素C对心肌缺血再灌注损伤保护作用的研究

基础医学院，山东第一医科大学(山东省医学科学院)，山东 泰安 271016

急性心肌梗死是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌组织坏死，是临床上的常见病和多发病，有较高致死致残率，主要的治疗方式是再灌注，即再通冠状动脉，恢复组织氧供。但血流的恢复可致缺血/再灌注(I/R)损伤，最终导致心肌梗死，且面积可达50%[1]。目前，I/R损伤已证明与氧化应激、钙超载、炎症反应、能量代谢障碍等诸多因素密切相关，但更详细机制仍未完全明确。维生素C为临床常见且广泛使用的抗氧化药物，川穹嗪在抗氧化应激方面的作用已被广泛认同，在此基础上，本试验拟观察川穹嗪和VitC联合应用于缺血再灌注心肌损伤的作用效果，重点观察对家兔心肌I/R心功能、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)、丙二醛(malon dialdehyde，MDA)及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)和心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)的影响，为药物联合应用改善心肌梗死提供思路与理论上的依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物及试剂

盐酸川穹嗪注射液，维生素C注射液。超氧化物歧化酶测定试剂盒、丙二醛测定试剂盒、乳酸脱氢酶测定试剂盒、谷胱甘肽试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。肌钙蛋白(cTnI)购自北京百奥莱博科技有限公司。

1.2 动物和实验分组

新西兰大白兔(雄兔)40只，体重2.6～3.0 kg，由济南西岭角养殖繁育中心提供。随机分为4组，每组10只：假手术组(A组)，只穿线不结扎冠脉；缺血/再灌注组(B组)；川穹嗪组(C组)；川穹嗪+VitC组(D组)。

1.3 仪器

动物呼吸机，BL-410生物机能实验系统，紫外分光光度计，离心机。

1.4 家兔心肌I/R模型的制作[2]

麻醉：自耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠(按照30 mg/Kg)，将家兔仰卧位固定于实验台上。气管插管：粗剪刀被皮，在距离胸骨上1 cm的正中线处，剪开皮肤，分离皮下组织。胸骨舌骨肌与甲状软骨下分离气管及其与食管之间的结缔组织和肌肉，游离气管，于气管下穿两根较粗结扎线，于甲状软骨下缘1～2 cm处的气管两软骨环间，做倒“T”形切口，如气管内有血液或分泌物，应先用棉签揩净，插管，结扎固定。(注意:上述操作应尽快完成以防止麻醉时间过长对家兔造成过大的不良影响甚至缺氧死亡，在操作过程中可以用止血钳向外拖拽家兔舌头刺激其呼吸，减轻呼吸道分泌物对呼吸道的阻塞)。开胸：用止血钳沿胸骨左缘1～2 cm处夹断第3、4肋(夹断肋骨后不要立刻松开止血钳防止出血，一段时间后再松开止血钳)，放入开胸器暴露心脏，剪开心包，提起左心耳暴露心前血管(如果出现气胸，连接小型动物呼吸机，呼吸频率40次/min，潮气量15 ml/kg)。结扎：从左心耳根部下约3 mm处进针(选用眼科缝合针，创口小，对心壁的损伤小，不易扎破心壁)，结扎线穿过浅层心肌，横跨前室间沟从肺动脉圆锥旁出针，放置松解拉线后结扎冠脉前降支(LAD);结扎家兔冠状动脉前降支30 min，随后提拉松解拉线解除结扎，再灌注120 min，同时给予生理盐水10 ml，静注5 min(缺血/再灌注组)；结扎冠状动脉前降支30 min，随后提拉松解线解除结扎，再灌注120 min，同时给予川穹嗪20 mg/kg加生理盐水至10 ml静注5 min(川穹嗪组)；结扎冠状动脉前降支30 min，提拉松解线解除结扎，再灌注120 min，同时给予川穹嗪20 mg/kg，维生素C 30 mg/kg加生理盐水至10 ml静注5 min(川穹嗪+VitC联用组)[3]。结扎成功的标志为心电图ST段弓背向上抬高，松开结扎线，提拉松解线恢复冠脉血流，抬高的ST段下降50%以上即证明再灌注成功。

1.5 检测指标

1.5.1心功能的测定 颈部皮肤切开后，暴露并钝性分离出左颈总动脉，结扎远端，由近端将动脉导管自左颈总动脉插入左心室，插管插入动脉初描记波形为动脉血压，当波形变成下沿达0 mmHg以下具有明显舒张期而峰顶平坦的波形时，表明导管已通过主动脉瓣进入左室腔内，显示器上所示即为左室内压，一般插入深度约10～12 cm，并经压力换能器与BL-420生物机能实验系统连接，计算机通过BL-420生物机能实验系统，进入血流动力学模块，记录缺血前、缺血15 min、缺血30 min和复灌30 min、复灌120 min时左心室收缩峰压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)和左室内压最大收缩/舒张变化速率(±dp/dtmax)。

1.5.2SOD、GSH-PX和LDH活性以及MDA含量检测 各组于缺血前、缺血30 min和复灌60 min时，由股动脉取血2 ml，3000 r/min离心15 min，收集上清。采用南京建成生物工程研究所研制的SOD、GSH-PX、MDA、LDH测定试剂盒进行测定，根据公式，计算家兔心肌组织中的SOD、GSH-PX和LDH活性以及MDA含量。

1.5.3制作心肌石蜡切片并行HE染色 于复灌结束后，原位结扎左前降支(LAD)，取出心脏，用生理盐水漂洗心腔内积血，沿垂直于心脏长轴的方向，自心尖到结扎部位，剪下正常组织区与坏死区及其相连部分，脱水包埋进行HE染色处理：70%乙醇，过夜;80%乙醇，2 h；90%乙醇，1 h；95%乙醇，1 h，1 h；100%乙醇1 h，40～50 min；酒精∶二甲苯为1∶1，30 min；二甲苯，30 min，40 min；浸蜡，2.5 h；待蜡块凝固后修块，切片机切片，展片机充分展开后，用载玻片承载制成标本。HE染色：二甲苯20 min，10 min;无水乙醇，5 min，5 min；95%乙醇，5 min；90%乙醇，2 min；80%乙醇，1 min；蒸馏水，10 min；苏木素，10 min，蒸馏水冲洗；1%盐酸酒精，一蘸即可，蒸馏水冲洗；蒸馏水，20 min；伊红，5 min，蒸馏水冲洗；80%乙醇，3 s；90%乙醇，3 s；95%乙醇，30 s，30 s；无水乙醇，2 min，3 min；二甲苯5 min，10 min；中性树胶封片后显微镜下观察。

1.5.4检测心肌肌钙蛋白I 采用免疫组化SP法。常规制备心肌组织切片，脱蜡水化后加入适量的内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10 min；PBS缓冲液冲洗3 min×3次；滴加100 μL或适量的封闭用山羊血清工作液，室温孵育10～15 min，倾去血清，勿洗；根据组织大小，滴加100 μL或适量的一抗，37℃孵育60 min；PBS缓冲液冲洗3 min×3次；滴加100 μL或适量的生物素标记山羊抗兔IgG，室温孵育10～15 min；PBS缓冲液冲洗3 min×3次；滴加100 μL或适量的辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育10～15 min；PBS缓冲液冲洗3 min×3次；加入适量新鲜配置的DAB显色液，室温孵育5～8 min；自来水冲洗，苏木素染色液孵育3～5 min；分化，冲洗返蓝；脱水、透明、封片、阅片。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 家兔心功能

家兔缺血心肌恢复供血后，心脏功能进一步恶化，川穹嗪能减轻LVSP和±dp/dtmax下降幅度，表明川穹嗪可改善心功能；川穹嗪和VitC联用组对心功能的改善更加明显。见表1。

表1 血流动力学检测指标

注:与A组比较，#P<0.05;与B组比较，*P<0.05;与C组比较,△P<0.05。

2.2 川穹嗪和VitC对I/R家兔心肌细胞SOD、MDA和LDH的影响

C组和D组与B组比较，心肌SOD活性增加(P<0.05)，MDA含量下降(P<0.05)，GSH-PX活性增加(P<0.05)，LDH活性下降(P<0.05)；D组与C组比较，心肌SOD活性增加(P<0.05)，MDA含量下降(P<0.05)，GSH-PX活性增加(P<0.05)，LDH活性下降(P<0.05)。见表2。

2.3 各组心肌组织病理学改变

A组心肌形态结构基本正常，肌纤维炎性细胞浸润，间质充血；B组心肌排列紊乱，心肌细胞变性，排列整齐；C组心肌细胞排列较紊乱，有细胞变性；D组心肌细胞排列较为整齐，有少量细胞变性及间质充血。见图1。

2.4 各组心肌组织cTnI表达

A组心肌细胞纵切面可见附着于肌横纹位置棕褐色颗粒呈“横纹样”分布，间质血管内红细胞为免疫组化阴性。B组细胞核细长固缩偏移染色深,结构破坏，细胞分界不清，胞膜处呈褐色为cTnI大量表达。C组细胞形态较整齐，核破坏较B组轻，且细胞膜处cTnI呈褐色表达减少。D组细胞形态较整齐，核破坏较轻，且细胞膜处cTnI呈褐色表达明显减少。见图2。

表2 SOD、MDA和GSH-PX活性以及LDH含量检测

注:与B组比较，aP<0.05;与C组比较，bP<0.05。

图1 各组心肌组织病理学改变(HE×400)

图2 心肌组织免疫组化染色

3 讨 论

自由基的作用、细胞内钙超载、白细胞的激活(微血管的作用)是缺血再灌注损伤发生时的三大重要环节，细胞损伤为缺血再灌注损伤的共同病理改变。本实验主要关注两种药物联用对自由基作用的影响。实验数据表明，在家兔心肌缺血再灌注的模型中,C组家兔的心肌梗死面积和LDH水平低于B组，且D组效果优于C组，表明维生素C与川穹嗪连用可以有效保护心肌细胞膜的损伤，减少心肌酶的释放，改善心肌梗死。

自由基的生成增多来源于黄嘌呤氧化酶(XO)形成增多、中性粒细胞聚集和激活、线粒体膜损伤、儿茶酚胺自氧化增多，且与钙超载互为因果作用。缺血后的再灌注过程中产生的大量氧自由基和活性氧可以直接损伤心肌细胞，导致细胞的结构、功能改变，引起细胞损伤和死亡[4]。SOD、MDA、GSH-PX均为生物体内存在的与机体过氧化反应有关的相关酶类，为判断机体氧化与抗氧化能力、衡量氧自由基产生的指标。SOD是内源性的氧自由基清除剂，可清除生物体内氧化过程中产生的超氧离子，其水平间接反映机体清除氧自由基的能力。MDA是生物膜脂质过氧化反应时产生的重要产物，能较好反映组织脂质过氧化程度，是判断氧自由基对细胞损伤的标志之一[5]。GSH-PX可保护细胞膜的结构和功能不受过氧化物的干扰和损害，是机体抗氧化能力的指标之一。在本实验中，与I/R组相比，川穹嗪组SOD、GSH-PX活性增加而MDA含量降低，表明川穹嗪能有效减轻氧化应激水平，清除氧自由基，减轻脂质过氧化，保护线粒体结构和功能。这与文献报道[6-8]一致。本研究还发现，C、D两组家兔的心肌梗死面积较B组显著减少，LDH也显著降低，提示两者连用对心肌的保护作用可能是通过激发机体自身的内源性保护机制的结果，可与上述结论相互印证，但是否还有其他的酶参与还需进一步研究。

cTnI由于其具有严格的心肌组织特异性及高度敏感性，为诊断心肌损伤的特异性指标之一，在心肌损伤的诊断及与其他组织损伤的鉴别中具有重要意义。与常规心肌酶及cTnT相比，在急性期相似的敏感度基础上，cTnI具有更高的特异性。国内外已有少数关于心肌缺血梗死cTnI的研究，研究结果表明，cTnI的检测要优于cTnT和CK-MB，它不仅敏感性、特异性高，且具有更宽的检测时间窗[12]。本实验结果显示，心肌缺血再灌注后与结扎前相比，cTnI表达增加且细胞外大量表达，证明缺血再灌注使心肌细胞受到了损伤；注射川穹嗪后cTnI表达减少，说明川穹嗪能缓解心肌细胞的缺血缺氧，减轻了心肌细胞的再灌注损伤；川穹嗪+VitC组cTnI表达进一步减少，表达部位集中在细胞膜，表明两药联用进一步减轻了心肌细胞受到的损害，并且减少了酶的外漏，在保护心肌上有良好的效果。

实验数据表明，与传统单独使用川穹嗪比较，维生素C与川穹嗪联合应用能有效的清除MDA、LDH，减轻出血，免疫组化示cTnI溢出减少，心肌组织恢复情况良好[9]。二者联用能进一步抑制中性粒细胞的氧化代谢，清除自由基，降低心肌细胞的自律性，减少室颤的发生几率，对心律失常的发生具有一定的保护作用[10-11]。心肌缺血再灌注损伤使心肌的舒缩功能降低，心肌储能迅速降低破坏，心肌结构比如肌原纤维破坏、线粒体损伤等，引发心肌顿抑、再灌注性心律失常、心肌坏死等结果，该实验研究结果可为某些医疗技术的应用比如冠脉搭桥、PICA、溶栓疗法等以及体外循环条件下进行的心脏手术、心肺脑复苏(CPR)等提供治疗保护的新思路。