石榴皮多酚的抗氧化性及其对PC12细胞增殖的影响

山东第一医科大学(山东省医学科学院)，山东 泰安 271016

石榴不仅营养丰富，而且富含多种生物活性物质，具有多种防病治病功效[1]，是历代药典中的重要中药，其中多酚类是石榴皮中含量最为丰富的一类活性物质[2]。国内外大量研究结果表明石榴皮多酚在预防和治疗肿瘤、心脑血管疾病、糖尿病等方面具有明显效果[3]。当今人们越来越重视天然植物活性成分对疾病的预防和治疗，对石榴皮多酚类物质进行研究，不仅可以深化人们对石榴功能价值的认识，而且可以为石榴合理开发和利用奠定科学基础。本研究采用冷浸过夜的方法从石榴皮中提取多酚，并采用福林酚比色法测定其含量，DPPH和ABTS法测定石榴皮多酚体外抗氧化活性，MTT法测定石榴皮多酚对细胞增殖的影响，为石榴皮的综合开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

石榴皮：购于泰安中药材市场，经山东第一医科大学药学院孙立彦副教授鉴定为石榴科(Punicaceae)石榴属植物石榴(PunicagranatumL．)的干燥果皮，符合中国药典2015 年版标准。

试剂：1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(Sigma)，DMEM培养基(Gibco)，新生牛血清(四季青)，胰蛋白酶(Solorbio)，MTT(Solorbio)，吉姆萨染料(北京诺博莱德科技有限公司)，其余试剂均为国产分析纯。

主要仪器：CO2培养箱(Themo Fisher)，倒置显微镜(XDS-1)，超净工作台，高压灭菌器(MJ3760D)，电热鼓风干燥箱，酶联免疫检测仪(BJ000624)，紫外可见分光光度计(752s)。

细胞株：小鼠肾上腺嗜铬细胞(PC12细胞)，购自中国细胞库典藏细胞中心，并由本实验室冻存，在37℃、5%CO2培养箱传代培养。

1.2 方法

1.2.1石榴皮多酚提取物的制备

溶剂萃取法是传统的提取方法，本实验用95%的乙醇粗提；然后用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取多次；而后旋转蒸发得石榴皮多酚。本实验使用的乙醇浓度为95%，料液比为1∶20，提取时间为48 h。

1.2.2石榴皮中总多酚含量的测定

1.2.3体外抗氧化活性分析

DPPH·自由基清除率的测定[4]：将40 mg DPPH自由基溶于500 mL 70%乙醇中，配成0.08 mg/mL的溶液，以抗坏血酸(VC)为阳性对照，在517 nm处测定各样品的吸光度值，根据公式计算石榴皮多酚提取液的DPPH自由基清除能力。每个质量浓度组平行测定3次，取其平均值，测定结果以清除率表示。样品对DPPH·自由基的清除能力用下式表示：DPPH·清除率=[Ao-(As-Ab)]/Ao×100%，式中：Ao为4.00 mL DPPH自由基溶液+1.00 mL乙醇反应的吸光度值；As为4.00 mL DPPH溶液+1.00 mL石榴皮多酚提取液反应的吸光度值；Ab为4.00 mL已醇+1.00 mL石榴皮多酚提取液反应的吸光度值。

ABTS+自由基的清除作用分析：ABTS+自由基清除法已被广泛应用于生物样品总抗氧化能力的测定。用pH 7.4的PBS溶液配制7 mmol/L的ABTS+工作液，与2.5 mM过硫酸钾1∶1混合，再用PBS(pH=7.4)稀释到734 nm下吸光度为0.7，在冰箱中保存备用。在反应体系中加入50 μL多酚提取液，再加入3 mL ABTS+工作液，振荡摇匀，于室温下避光静置6 min，测定溶液在734 nm下的吸光度值。ABTS+清除率=(1-As/Ao)×100%，其中As为样品管的吸光度值，Ao为对照管的吸光度值。以样品浓度对自由基清除率进行线性拟合，并计算IC50值。其中IC50定义为清除率为50%时所需抗氧化剂的浓度[5]。

1.2.4石榴皮多酚提取物对细胞形态和细胞增殖的影响

MTT 试验：取对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化，1 000 r/min 离心5 min，完全培养基重悬、计数，调整细胞浓度为每毫升6×103个，每孔100 μL接种至96 孔板。37℃、5% CO2培养箱中培养24 h。加入20 μL不同浓度的石榴皮多酚提取液，使其终浓度分别为100、80、60、40、20、10 μg/mL，同时设定阴性对照组0 μg/mL(即只加细胞，不加提取液)。每组重复5次。培养箱中继续培养24 h ，取出培养板，每孔加入10 μL 5 mg/mL 的MTT 溶液，细胞培养箱内继续孵育4 h。然后每孔加入二甲亚砜溶解液100 μL，平板摇床振摇5 min，使结晶紫颗粒溶解。使用酶联免疫检测仪在波长490 nm测定吸光度值(A490)，计算生长存活率：存活率(%)=A试验组/A阴性对照组×100%。

细胞形态观察：将细胞制成单细胞悬液，接种至25 mL 培养瓶中，每瓶4 mL。培养24 h，加入不同浓度的石榴皮多酚提取物，同时设定不加药的阴性对照组。培养箱中培养24 h ，倒置显微镜下观察细胞的生长变化情况。

1.3 统计学处理

应用 SPSS 18.0 统计软件进行数据分析。采用Sigmaplot 12.5 软件作图。

2 结 果

2.1 石榴皮多酚提取物中多酚含量测定

将石榴皮多酚提取液按前述方法配制好后放置显色40 min，以相应试剂为空白，用紫外可见分光光度计，在760 nm波长处测定其吸光度值，平行测定3次，对照没食子酸标准曲线和线性回归方程得出石榴皮多酚含量。石榴皮提取物中的总多酚含量为其干重的18.40%。

2.2 石榴皮多酚提取液体外抗氧化研究

2.2.1石榴皮多酚提取液自由基清除能力

DPPH·自由基经常被用来作为测试抗氧化性试剂，通过对抗氧化剂样品直接捕获或与DPPH·自由基相结合行为的研究，来衡量抗氧化剂的清除能力。许多高活性自由基在细胞新陈代谢中不断产生，由于其能诱发细胞辐射损伤、自身免疫缺陷病以及癌症等病症，必须及时对其清除，因此寻找天然的抗氧化剂就显得十分必要。体外抗氧化实验反应迅速、操作简单，在食品药品的抗氧化效果评价中应用广泛。

根据实验方法配制不同浓度的溶液，取上清液在波长517 nm处测其吸光度，根据公式计算石榴皮多酚提取液对DPPH·自由基清除能力，结果如图1。

由图1可知，石榴皮多酚提取液对DPPH自由基有较强的清除能力，在较低浓度下已经有较高的清除率；随着多酚浓度的增加，对自由基的清除率也增强，在1～10 μg/mL的范围内呈现较好的量效关系，根据IC50值显示，石榴皮多酚提取液半抑制浓度(IC50)为3.64 μg/mL，低于5 μg/mL，强于Vc(IC50=5.38)的DPPH自由基清除活性。

图1 石榴皮多酚提取物的DPPH自由基清除能力

2.2.2石榴皮多酚提取物的ABTS+自由基清除能力

以抗坏血酸(Vc)作阳性对照，测定结果如表1,2和图2所示，随浓度的升高，两者对ABTS+的清除率均增加。在测定浓度范围内，石榴皮多酚提取物浓度与ABTS+清除率之间呈线性关系。在浓度<10.0 μg /mL 时，提取物的清除率明显大于Vc；当浓度≥15.0 μg /mL 时，提取物和Vc 的自由基清除率相差不大，清除率大于70%。且石榴皮多酚提取物IC50值(2.63)比对照Vc(2.99)小，说明石榴皮多酚提取物有较强的ABTS+自由基清除能力。

2.3 石榴皮多酚提取物对细胞影响的分析

本实验通过测定细胞吸光度的变化来测定细胞数量的变化。由图3可知，PC12细胞在经过消化传代后，6天时间内连续观察，第1、2天是PC12细胞的生长潜伏期，细胞生长缓慢；第3、4、5天为对数生长期，在电子显微镜下细胞为多角形贴壁生长，第5天的时候基本融合。

2.3.1石榴皮多酚提取物对细胞形态的影响

将加入石榴皮多酚提取物前后的PC12细胞在倒置显微镜下观察细胞的生长情况，结果如图4，5所示：传代后约6 h PC12 细胞贴壁，贴壁后的PC12细胞爬壁生长，细胞质内物质分布均匀，呈颗粒状，可见圆形的细胞核(图4)。细胞铺满瓶底时，细胞之间紧密连接，互相连成片。加入石榴皮多酚提取物后，倒置显微镜下可见细胞形态发生改变，部分细胞收缩呈类圆形，有大量致密的颗粒物质聚集于细胞膜下，细胞中部密度显著降低几乎观察不到细胞核。细胞贴壁能力下降，细胞之间的连接减少，细胞与细胞之间几乎不能连接成片而出现空隙，部分提取物作用后出现较多细胞悬浮现象。

2.3.2石榴皮多酚提取物对细胞存活率的影响

恶性肿瘤的生物学特性之一是细胞过度增殖，控制癌细胞繁殖程度可反映肿瘤的治疗效果。为了研究石榴皮多酚对PC12细胞是否具有增殖抑制作用，本实验采用MTT法测定石榴皮多酚提取物对细胞存活率的影响，结果如表3和图6所示：石榴皮多酚提取物作用PC12 细胞24 h 时，对细胞的抑制率和石榴皮多酚浓度呈正相关。随石榴皮多酚浓度增大，对PC12细胞抑制率也随之增大，抑制程度和浓度的关系可分为3种：0～10 μg/mL抑制率可以忽略，在20～40 μg/mL抑制率差异不大，60～100 μg/mL抑制率明显增高。从图6可得：石榴皮多酚对细胞的增殖有抑制作用且与石榴皮多酚的浓度有相关性，随多酚浓度的升高，对细胞增殖的抑制作用越明显。

表1 石榴皮多酚提取物的ABTS+自由基清除能力

表2 Vc的ABTS+自由基清除能力

图2 石榴皮多酚提取物的ABTS+自由基清除能力

图3 PC12细胞吸光度与培养天数的关系

图4 加入石榴皮多酚前的PC12细胞形态

图5 加入石榴皮多酚后的PC12细胞形态

浓度 (μg/mL)吸光度123平均存活率(%)00.8220.8160.8180.819100 100.8180.8140.8220.818100 200.8060.8080.8040.80698 400.7510.7530.7490.75192 600.7010.7030.6930.69985 800.6190.6150.6260.62076 1000.5010.5120.5180.51062

图6 不同浓度石榴皮多酚提取物对PC12细胞存活率的影响

3 讨 论

石榴皮多酚提取液对DPPH·自由基和ABTS+自由基的清除实验表明，石榴皮多酚提取物具有较强的清除自由基能力，可作为天然抗氧化剂清除体内正常代谢所产生的羟自由基、超氧阴离子等活性氧自由基，避免自由基失衡诱发机体的快速衰老和恶性肿瘤，为石榴多酚的综合应用提供理论依据。但是其抗氧化活性的具体机理，还需对各组分分离后进行进一步生物学研究。

石榴皮多酚提取物对PC12细胞的增殖有抑制作用且与石榴皮多酚的浓度有相关性，随多酚浓度的升高，对细胞增殖的抑制作用越明显。石榴皮多酚在体外可诱导PC12凋亡，具有较好的抗肿瘤活性，但其抗肿瘤作用机制还需进行细胞内和相对应的动物实验，其机制可能与细胞内凋亡相关基因的表达变化有关。