IRP患者骨髓单个核细胞中CD28/B7家族共刺激分子mRNA表达研究

陈龙 范丽萍 张永为 王剑超

免疫相关性全血细胞减少症（immune- related pancytopenia，IRP）是近年来新认知的一类骨髓衰竭性疾病，临床上常表现为二系或二系以上的血细胞减少，但其不同于其它已经认知的骨髓衰竭性疾病，IRP 主要特征是由于骨髓造血细胞表面产生了自身抗体，影响了造血细胞的分化发育，从而引起外周血细胞减少。该类患者外周血抗人球蛋白试验（COOMBS试验）呈阴性，但骨髓单个核细胞 COOMBS 试验或流式细胞技术均能检测到造血细胞自身抗体的存在。国内许多学者已对IRP疾病发病机制进行了初步研究［1］，发现IRP患者的B淋巴细胞数量、亚群、功能存在异常，尤其当T细胞活化异常介导的 B1群（CD5+的B细胞）数量增多，功能亢进可能是产生抗骨髓未成熟造血细胞自身抗体的主要原因［2-3］，但影响T细胞活化和分化的 CD28/B7 家族共刺激分子在IRP中是否存在表达异常尚不明确，有必要进一步分析讨论。

1 临床资料

1.1 一般资料 收集本院2010年10月至2016年10月间门诊和住院患者确诊为IRP患者骨髓样本20例及20例阴性对照骨髓样本，考虑到临床可行性和较易获取可能性，拟采用诊断为缺铁性贫血（IDA）患者骨髓样本20例作为阴性参照（IDA是一种单纯的缺铁性贫血，其生理生化性质与正常人基本相同）。40例样本均来自浙江中医药大学附属第二医院血液科收治并经临床确诊患者，年龄33～82岁，中位年龄58岁，男女比3∶2，患者本身无严重基础疾病，所有样本采集均征得患者本人同意下获得。IRP患者入选标准：（1）患者外周血呈一系、二系或全血细胞减少；（2）患者骨髓中红系细胞比例不低，或骨髓象可见“红系造血岛”；（3）能够明确独立不同于其他各类血液或骨髓衰竭疾病；（4）骨髓单个核细胞 Coomb's 试验阳性；（5）临床免疫抑制疗法对其有效。

1.2 实验试剂 Ficoll 密度梯度离心液、Trizol 试剂盒、氯仿、无水乙醇、DEPC 水、TaqDNA 聚合酶、PrimeScript TMΠ 1st-strand cDNA Synthesis kit、SYBR Green Master kit、β-action 质粒标准品、5× Reverse Tan-scriptase M-MLV Buffer 、10x 细胞裂解液、CTLA-4'CD28'CD80'CD86mRNA 探针及引物合成、RPMI1640培养液。

1.3 实验方法与观察指标 40例骨髓样本均采用EDTA抗凝管采样2ml，用30μm尼龙滤网过滤掉骨髓中的细胞团块及凝块，然后采用 Ficoll 密度梯度离心法分离BM-MNCs，将各组分离出来单个核细胞进行显微镜计数细胞总数，然后用RPMI1640培养液调整细胞浓度，将40例骨髓样本中单个核细胞处于同一细胞浓度约3×104/μl，然后每个样本各取200μl按Trizol 试剂说明书操作过程提取每个样本的总 RNA，按 RNA 逆转录试剂盒说明书操作将总 RNA 逆转录为 cDNA，cDNA 样本-80℃保存。设计相应的PCR反应体系，进行目标基因的循环扩增指标检测。采用 RTPCR 扩增仪分析软件，以空白对照作为标准基线，参考标准品相应浓度形成的扩增曲线来换算待测样本中每个目的基因的表达含量，采用相对定量的方法，用内参基因（actin-β）将目的基因（CTLA-4，CD28，CD80，CD86）校正至 108copies/ml，用目的基因校正值的拷贝数取对数值为最终有效数据来进行统计分析。

1.4 统计学分析 采用SPSS 17.0 统计软件。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用配对t检验，以 P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

IRP患者组和IDA对照组骨髓单个核细胞中CTLA-4、CD28、CD80、CD86mRNA表达见表1。

表1 IRP和IDA骨髓单个核细胞中CD28/B7家族共刺激分子mRNA的表达［copies/ml，（x±s）］

3 讨论

目前认为IRP作为一类骨髓方面的血液系统疾病，其主要特点是此类疾病患者的骨髓造血细胞表面存在自身抗体（而在外周血中细胞表面未检测到自身抗体），骨髓造血细胞表面的自身抗体在髓内直接引起破坏或抑制造血细胞，导致骨髓造血功能减退或无效造血，从而引起患者外周血中全血或二系细胞减少，关于IRP的发病机制的研究，目前主要的研究认为IRP是由于T淋巴细胞（TH）调控失衡导致B淋巴细胞（CD5+）数量、亚群、功能异常，从而引起患者骨髓中免疫调节紊乱，免疫平衡破坏，骨髓中造血前体血细胞表面抗原簇结合相关自身抗体，继而被吞噬破坏、凋亡，造血细胞数量急剧下降，长此以往，最终引起患者外周血中血细胞减少［4］。虽然有关于T细胞调节失衡引发B细胞增殖活化异常，最终导致自身相关性抗体产生是IRP的主要可能的发病机制，但是有关于IRP中T细胞的增殖活化调控机制目前仍不清楚，未见相关的报道。

CTLA-4/CD28-B7共刺激通路是T细胞活化的上游调控机制，是其活化过程中必不可少的刺激信号［5-6］，因此，通过研究CTLA-4/CD28 -B7共刺激通路对T细胞增殖分化的影响，能够帮助我们对IRP发病机制有更进一步的了解。本实验将共刺激分子CTLA-4、CD28、CD80及CD86作为研究目标，通过研究IRP患者骨髓造血细胞中CTLA-4、CD28、CD80及CD86四类共刺激分子的mRNA表达，来了解共刺激通路与IRP发病机制及其对T细胞调控间的关系。

本实验证实IRP患者骨髓单个核细胞中CD28/B7家族共刺激分子mRNA存在异常表达，具体表现为CTLA-4mRNA表达明显下降，CD28及CD80/CD86虽有下调但是较前者不明显，CTLA-4在共刺激通路中占主导地位，CTLA-4mRNA表达下降可能导致T细胞增殖过度活化（尤其是TH2细胞），导致TH1/TH2比例倒置，TH1细胞功能受抑制，TH2细胞功能亢进，分泌大量正性刺激因子促进B细胞活化增殖，抑制B细胞凋亡，可能导致CD5+B1群细胞过度活化，而CD5+B1群细胞与产生自身抗体有关，最终导致骨髓造血细胞产生自身抗体，引起外周血细胞减少。作者从 CTLA-4/CD28/B7共刺激通路角度，为临床进一步了解 IRP 发病机制提供了新的思路和方向。