软坚消瘿颗粒对肝郁脾虚型桥本甲状腺炎大鼠甲状腺细胞凋亡的影响

李叙颖， 张 兰， 王 琳， 武佳琦， 范思有， 刘 佳

（1. 辽宁中医药大学， 辽宁 沈阳 110847； 2. 辽宁中医药大学附属医院， 辽宁 沈阳 110032）

桥本甲状腺炎常以甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）、 甲状腺球蛋白抗体（TGAb） 升高为主要特征， 最终大多数患者发展为甲状腺功能减退症， 是由多种致病因素相互作用而造成的。 研究表明， 细胞凋亡与桥本甲状腺炎发生发展密切相关，凋亡大多发生于浸润淋巴滤泡附近， 是患者甲状腺滤泡细胞和腺体破坏的重要机制之一[1-3］。 软坚消瘿颗粒是辽宁中医药大学附属医院张兰教授以《太平惠民和剂局方》 中逍遥散为基础方化裁， 具有疏肝健脾、 软坚消瘿功效的中药复方， 本实验拟考察该制剂对肝郁脾虚型桥本甲状腺炎大鼠甲状腺细胞凋亡的影响， 以期探讨相关治疗机制。

1 材料

1.1 动物 SPF 级雌性SD 大鼠， 体质量160 ～180 g， 由辽宁长生生物技术有限公司提供， 动物生产许可证号SCXK （辽） 2015-0001， 适应环境7 d后开始实验。

1.2 药品 软坚消瘿颗粒由柴胡、 白芍、 茯苓、白术， 当归、 海藻、 昆布等药材组成， 经江阴天江药业有限公司制成颗粒剂； 雷公藤多苷片（江苏美通制药有限公司， 国药准字Z32021007）。 无水碘化钠、 甲状腺球蛋白（安徽酷尔生物工程有限公司， 货号AQ032244、 QA052105）； 弗氏不完全佐剂、 弗氏完全佐剂 （美国Sigma 公司， 货号F5506、 F5881）。

1.3 试剂 TPO-Ab、 TGAb 酶联免疫分析试剂盒（上海酶联生物科技有限公司， 货号m1048720、m1003044）； BCA 蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物 技 术 研 究 所， 货 号 P0010S）； 兔 抗 TLR2、TLR4、 My D88、 NF-κB p65 抗体（武汉博士德生物科技有限公司）； HRP 标记山羊抗兔IgG （北京中杉金桥生物科技有限公司）； ECL 发光试剂盒（北京索莱宝生物科技有限公司， 货号PE0010）；TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒（南京凯基生物科技有限公司）。

1.4 仪器 酶标仪[赛默飞世尔（上海） 仪器有限公司， Multiskan MK3 型］； 低温高速离心机（德国Heraeus 公司， D-37520 型）； 数显电子恒温水浴锅（常州国华电器有限公司， SHA-B 型）； 石蜡 切 片 机 （RM2235 型）、 组 织 石 蜡 包 埋 机（EG1150 型）、 全自动脱水机（ASP300 型） （德国徕卡公司）； 电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂， HHB11500 型）； 荧光显微镜（日本Olympus公司， BX51 型）； 电泳仪（EPS300 型）、 凝胶成像分析系统（Tanon-4200SF 型）、 垂直板电泳装置（VE-180 型） （上海天能科技有限公司）； 转印电泳槽（北京六一仪器厂， DYY-40B 型）。

2 方法

2.1 模型建立

2.1.1 药物制备

2.1.1.1 高碘水 将0.64 g 碘化钠晶体与1 L 蒸馏水混合， 即得（0.64 g／L）。

2.1.1.2 抗原溶液 1 mg／mL 甲状腺球蛋白溶于PBS 缓冲液中， 即得。

2.1.1.3 初次免疫乳化剂 取等量弗氏完全佐剂、抗原溶液（体积比1 ∶1）， 通过2 个细胶管相连的注射器交替推动制得黏稠乳剂（100 μg／0.2 mL），现配现用。

2.1.1.4 加强免疫乳化剂 取等量弗氏不完全佐剂、 抗原溶液（体积比1 ∶1）， 按“2.1.1.3” 项下方法制得油包水乳状液（100 μg／0.2 mL）。

2.1.2 桥本甲状腺炎模型 48 只大鼠适应性喂养1 周后， 随机取12 只作为正常组， 剩余为造模组，分笼饲养， 每笼6 只。 从第2 周起， 造模组大鼠饮用高碘水， 正常组大鼠给予蒸馏水； 第4 周第1、4 天， 造模组大鼠于双后足皮下多点注射初次免疫乳化剂， 0.2 mL／只， 第5～8 周后背皮下多点注射加强免疫乳化剂， 0.2 mL／只， 每周1 次。

2.1.3 肝郁脾虚证模型 从第5 周起， 造模大鼠采用慢性束缚应激、 过度疲劳、 饮食失节等复合方法进行造模， 首先用自制束缚筒限制大鼠活动， 每天1 h； 单日令其游泳至耐力极限， 同时喂饲甘蓝；双日喂饲正常颗粒饲料， 同时灌胃给予猪油脂（1 mL／100 g 体质量）， 连续4 周。

2.1.4 模型评价 造模后（即第9 周） 第1 天，各组大鼠球后静脉丛穿刺采集全血2 mL， 分离血清， 检测TGAb、 TPOAb 水平， 比较正常组、 造模组两者水平以判断模型是否建立成功。

2.2 分组及给药 将造模大鼠随机分为模型组、雷公藤多苷片组、 软坚消瘿颗粒组， 每天灌胃2 次（9： 00、 15： 00 点各1 次）， 给药周期为8 周， 给药剂量参考《药理实验方法学》[4］， 并根据人与大鼠体表面积等效剂量进行换算。 正常组、 模型组大鼠每次给予2 mL 蒸馏水； 雷公藤多苷片作为阳性对照药， 研磨后溶于蒸馏水中配成混悬液， 每天给药剂量为9.45 mg／kg 生药量， 分2 次灌胃； 软坚消瘿颗粒置于量杯中， 煮沸蒸馏水稀释， 溶液充分搅拌均匀， 每天给药剂量为16.17 g／kg 生药量，分2 次灌胃。

2.3 标本采集 治疗后大鼠禁食不禁水24 h， 腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL／kg） 麻醉， 沿腹白线剪开腹腔， 腹主动脉釆血， 分离血清， -80 ℃下冻存备用， 从大鼠头颈部气管处迅速取出甲状腺，分为2 份， 1 份置于冻存管中， 液氮中速冻，-80 ℃低温冰箱中保存； 另1 份置于10%福尔马林溶液中固定， 常温保存， 用于石蜡切片。

2.4 指标检测

2.4.1 血清甲状腺抗体 ELISA 法检测血清TGAb、 TPOAb 水平， 具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

2.4.2 甲状腺细胞凋亡数 每只大鼠观察3 张切片， 按照TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒说明书进行染色， 荧光显微镜采集图像， 镜下可见黄绿色的阳性细胞。 每张切片在显微镜下（×200） 选取5个互不重叠视野， 计数阳性细胞， 取平均值， 作为甲状腺细胞凋亡水平。

2.4.3 甲状腺组织TLR2、 TLR4、 MyD88、 NF-κB p65 蛋白表达 采用Western blot 法。 取甲状腺组织100 mg， 加入含蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液1 mL， 冰上研磨匀浆， 4 ℃离心取上清， BCA 法检测各样品中蛋白含有量， 确定上样量， 将配置好的分离胶和浓缩胶加到胶板中聚合， 煮沸后样品加入电泳凝胶上， 电泳分离蛋白， 电转移蛋白至PVDF膜上， 5% 脱脂奶粉封闭， 加入一抗 （TLR2、TLR4、 MyD88、 NF-κB p65 抗体均稀释1 ∶300， βactin 1 ∶1 000）， 4 ℃下孵育过夜， TBST 洗膜3次， 加入羊抗兔二抗（稀释1 ∶2 000）， 37 ℃下孵育1 h， TBST 洗膜3 次， ECL 发光试剂盒显影， 图像分析软件分析结果， 将TLR2、 TLR4、 MyD88、NF-κB p65 条带与对应β-actin 条带灰度值的比值作为蛋白相对表达量。

2.5 统计学分析 通过SPSS 19.0 软件进行处理，数据以表示， 2 组间比较采用独立样本t检验， 多组间比较采用单因素方差分析。 以P ＜0.05 为有显著性差异。

3 结果

3.1 模型评价 表1 显示， 与正常组比较， 造模组TGAb、 TPOAb 水平显著升高（P＜0.01）。

表1 2 组TGAb、 TPOAb 水平比较Tab.1 Comparison of TGAb and TPOAb levels between the two groups

表1 2 组TGAb、 TPOAb 水平比较Tab.1 Comparison of TGAb and TPOAb levels between the two groups

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01

正常组 12 3.75±0.38 3.65±0.31造模组 36 11.16±2.69∗∗ 10.82±2.64∗∗

3.2 软坚消瘿颗粒对TGAb、 TPOAb 水平的影响 表2 显示， 与正常组比较， 模型组TGAb、TPOAb 水平显著升高（P＜0.01）； 与模型组比较，软坚消瘿颗粒组两者水平显著降低（P＜0.01）。

表2 软坚消瘿颗粒对TGAb、 TPOAb 水平的影响s，n=10）Tab.2 Effects of Ruanjian Xiaoying Granules on TGAb and TPOAb levels s， n=10）

表2 软坚消瘿颗粒对TGAb、 TPOAb 水平的影响s，n=10）Tab.2 Effects of Ruanjian Xiaoying Granules on TGAb and TPOAb levels s， n=10）

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

组别 TGAb／（IU·mL-1） TPOAb／（IU·mL-1）正常组 3.69±0.45 3.50±0.41模型组 10.91±2.13∗∗ 10.23±2.64∗∗雷公藤多苷片组 6.26±0.90## 7.40±1.16##软坚消瘿颗粒组 4.74±0.55## 4.33±0.59##

3.3 软坚消瘿颗粒对甲状腺细胞凋亡数的影响表3、 图1 显示， 与正常组比较， 模型组细胞凋亡数显著升高（P＜0.01）； 与模型组比较， 软坚消瘿颗粒组其凋亡数显著降低（P＜0.01）。

表3 软坚消瘿颗粒对甲状腺细胞凋亡数的影响n=6）Tab.3 Effect of Ruanjian Xiaoying Granules on thyroid cell apoptosis count ±s， n=6）

表3 软坚消瘿颗粒对甲状腺细胞凋亡数的影响n=6）Tab.3 Effect of Ruanjian Xiaoying Granules on thyroid cell apoptosis count ±s， n=6）

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01。 由于作图需要，每组只选6 只大鼠

正常组 13.50±3.39模型组 254.67±37.96∗∗雷公藤多苷片组 63.33±7.50##软坚消瘿颗粒组 71.33±16.18##

3.4 软坚消瘿颗粒对TLR2、 TLR4、 MyD88、 NFκB p65 蛋白表达的影响 表4、 图2 显示， 与正常组 比 较， 模 型 组TLR2、 TLR4、 MyD88、 NF-κB p65 蛋白表达显著升高（P ＜0.01）； 与模型组比较， 软坚消瘿颗粒组4 种蛋白表达显著降低（P＜0.01）。

4 讨论

桥本甲状腺炎属于中医“瘿病” 范畴， 其发病主要与情志内伤、 饮食失调等因素有密切关系，从而导致肝郁脾虚， 机体脏腑功能失调， 气滞、 痰凝、 血瘀等搏结于颈前而发病。 前期研究已证实，基于疏肝健脾法组方的软坚消瘿颗粒具有明显降低桥本甲状腺炎动物模型甲状腺自身抗体水平、 减轻甲状腺组织淋巴细胞浸润、 抑制甲状腺细胞凋亡等多靶点作用[5］， 方中柴胡主要成分柴胡皂苷具有抗炎作用， 其机制是通过刺激肾上腺来促进肾上腺皮质系统功能， 而且该成分对致炎因子释放、 白细胞游走和渗出、 毛细血管通透性、 结缔组织增生等均有影响； 白芍总苷通过影响白三烯B4 生成起到抗炎和免疫调节作用； 当归可促进非特异性免疫功能， 其水煎液能显著抑制多种致炎剂引起的急、 慢性炎症， 显著增强动物腹腔巨噬细胞的吞噬功能，并且其中性油总酸有增强巨噬细胞的吞噬功能、 促进淋巴细胞转化的作用； 白术有健脾胃、 提高机体抗病能力作用， 能增强网状内皮系统吞噬功能， 提高淋巴细胞转化率， 促进细胞免疫功能， 并可增加IgG 含有量； 茯苓多糖能增强小鼠巨噬细胞吞噬功能， 而羧甲基茯苓多糖还有免疫调节作用； 海藻、昆布中碘和碘化物成分可使甲状腺机能恢复正常，腺肿缩小[6］。

表4 软 坚 消 瘿 颗 粒 对TLR2、 TLR4、 MyD88、 NF-κB p65 蛋白表达的影响±s， n=6）Tab.4 Effects of Ruanjian Xiaoying Granules on TLR2，TLR4， MyD88 and NF-κB p65 protein expressions ±s， n=6）

表4 软 坚 消 瘿 颗 粒 对TLR2、 TLR4、 MyD88、 NF-κB p65 蛋白表达的影响±s， n=6）Tab.4 Effects of Ruanjian Xiaoying Granules on TLR2，TLR4， MyD88 and NF-κB p65 protein expressions ±s， n=6）

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01。 由于作图需要，每组只选6 只大鼠

组别 TLR2 TLR4 MyD88 NF-κB p65正常组 0.258±0.060 0.262±0.055 0.243±0.036 0.242±0.023模型组 0.610±0.077∗∗0.633±0.111∗∗0.639±0.115∗∗ 0.666±0.069∗∗雷公藤多苷片组 0.438±0.078## 0.443±0.071## 0.432±0.090## 0.422±0.070##软坚消瘿颗粒组 0.456±0.066## 0.466±0.051## 0.443±0.059## 0.450±0.065##

图1 软坚消瘿颗粒对甲状腺细胞凋亡数的影响Fig.1 Effect of Ruanjian Xiaoying Granules on thyroid cell apoptosis count

图2 软坚消瘿颗粒对TLR2、 TLR4、 MyD88、 NF-κB p65 蛋白表达的影响Fig.2 Effects of Ruanjian Xiaoying Granules on TLR2， TLR4， MyD88 and NF-κB p65 protein expressions

细胞凋亡又称程序性细胞死亡， 是由细胞内特定基因操纵、 调控的细胞自杀行为， 在多细胞生物的生长、 发育、 死亡等过程中都存在[7］。 研究表明， 桥本甲状腺炎中T 淋巴细胞及其细胞因子介导的炎症反应可在甲状腺滤泡细胞中诱导凋亡， 最终导致腺体破坏， 并且参与了免疫应答和炎症的诱导和效应阶段[2，8］， 前期动物实验发现， 软坚消瘿颗粒可通过调节桥本甲状腺炎大鼠细胞因子Th1／Th2 平衡， 降低Fas、 Fas-L、 Bax 等促凋亡蛋白表达、 升高抗凋亡蛋白Bcl-2 表达， 抑制甲状腺细胞凋亡， 从而起到治疗自身免疫性甲状腺炎的作用[9］； 本实验发现， 该制剂治疗后肝郁脾虚型桥本甲状腺炎大鼠血清甲状腺特异性自身抗体水平明显降低， 甲状腺细胞凋亡数明显减少， 印证了它具有抑制桥本甲状腺炎大鼠甲状腺细胞凋亡的作用。

Toll 样受体（TLR） 是近年来发现的先天性免疫系统中细胞跨膜受体及病原模式识别受体之一，通过向胞内传导信号从而引起细胞免疫应答， 能识别病毒、 支原体、 细菌等多种病原微生物， 通过对固有免疫反应的激活作用， 影响促炎症因子和共刺激分子产生， 诱导适应性免疫发生[10］。 髓样分化因子88 （MyD88） 是含有TLR 结构域的接头蛋白，也是其信号通路中重要因子， 能激活下游多种信号， 其中TLR2、 TLR4 能先激活MyD88 依赖性通路， 再激活下游因子， 即核因子κB （NF-κB）， 然后将信息从胞浆传至胞核， 与相应顺式作用原件相结合， 调控一些炎性细胞因子的转录[11-14］。 近年来研究发现， 桥本甲状腺炎甲状腺组织中NF-κB p65 阳性信号位于淋巴滤泡间甲状腺上皮细胞胞浆和胞核内， 少数表达于浸润在甲状腺组织中的淋巴细胞， NF-κB 一方面可调控与炎症和免疫反应有关的许多炎症介质基因的表达[15］； 另一方面对细胞凋亡的作用是双向性调节， 既能抑制凋亡的发生，也能促进一些细胞凋亡的发生[16］， 在自身免疫性甲状腺疾病的病理发展过程中， 它通过促进甲状腺的炎症介质、 黏附分子、 趋化因子过度或持续表达， 可杀死携带特异抗原的细胞[17］。 由此可知，TLRs／MyD88／NF-κB 信号通路可直接转导凋亡信号， 介导甲状腺细胞凋亡； 也可先转导炎症信号，再介导甲状腺细胞凋亡。 本实验发现， 软坚消瘿颗粒治疗后肝郁脾虚型桥本甲状腺炎大鼠甲状腺组织中细胞凋亡数明显减少， 同时TLR2、 TLR4、MyD88、 NF-κB p65 等蛋白表达均明显下降。

综上所述， 软坚消瘿颗可粒通过抑制TLRs／MyD88／NF-κB 信号通路来减少肝郁脾虚型桥本甲状腺炎大鼠甲状腺细胞凋亡， 并减轻甲状腺组织滤泡细胞的破坏。