HBV阳性孕妇CD209/CD209L基因多态性与宫内感染的相关性研究

谢晓彬， 曾 艳， 邓晓华， 杨志宏

(广东省深圳市龙岗中心医院妇产科， 广东 深圳 518100)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)是引起乙型肝炎的病原体，在世界范围约有20亿感染者，其中超过3.5亿人是HBV携带者，15%～40%的感染者会发展为肝功能衰竭、肝硬化或肝癌，每年导致约100万人的死亡[1]。血液和血液制品传染、密切接触传染、医源性传染、母婴传染(宫内，分娩，母乳喂养)是HBV感染的主要途径，其中母婴传染约占HBV传染的50%。孕妇将HBV传染给子代，主要发生在3个时期：产前、产时和产后。产前传染，也就是宫内传染，即乙肝病毒通过胎盘感染胎儿[2]。在我国乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性孕妇的宫内感染率在15%～25%[3]。目前对HBV宫内感染的机理仍有待研究，但已证实遗传易感性和各种母体特征(即分娩方式，流产史，产前出血，母体HBV DNA载量和妊娠期HBV感染的血清标志物)均对宫内感染有影响[4-5]。树突状细胞特异性细胞内粘附分子(ICAM)-3抓取非整合素(CD209)和肝/淋巴结特异性ICAM-3抓取非整合素(CD209L)是都是跨膜C型凝集素，是钙依赖性碳水化合物结合蛋白，可以充当细胞粘附和病原体识别受体[6-8]。 研究表明CD209/CD209L可通过C-末端C-型碳水化合物识别结构域捕获人类免疫缺陷、埃博拉、乙型肝炎、登革热、巨细胞、SARS冠状等多种病毒[9-10]。本研究对HBV阳性孕妇CD209/CD209L基因多态性与宫内感染的相关性进行分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料以2016年1月-2018年6月在深圳市龙岗中心医院妇产科接生的HBV阳性孕妇110例为研究对象，根据新生儿是否出现宫内感染(以新生儿出生时注射乙肝疫苗和乙肝免疫球蛋白前抽取新生儿股静脉血检测 HBsAg≥0.05 IU/mL、HBV DNA>103 copy/mL为诊断HBV宮内感染的指标)分为感染组60例和非感染组50例。2组孕妇在年龄、孕周、HBV DNA等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究按照赫尔辛基宣言进行，经本院伦理委员会批准，孕妇参与前均签署书面知情同意书。

1.2 CD209、CD209L单核苷酸多态性的检测

1.2.1 血液中DNA样品的提取纯化 2组孕妇肱静脉抽血4 mL，加入EDTA-K2抗凝，5 000 r/min 离心5 min，弃除血清后加入人红细胞裂解液300 μL, 混匀震荡3 min,10 000 r/min 离心30 s，取400 μL裂解物置于含有20 μL蛋白酶K的2 mL微量离心管中，56℃温育10 min后，加入400 μL乙醇混匀。取700 μL混合物置于QIAamp旋转柱以8 000 r/min离心1 min，将QIAamp旋转柱置于2 mL收集管中，弃去滤液。重复离心步骤后，将500 mL AW1缓冲液加入旋转柱中，8 000 r/min离心1 min，将500 mL AW2缓冲液加入旋转柱中，8 000 r/min离心1 min。将QIAamp Spin Column置于1.5 mL微量离心管中，加入150 μLAE缓冲液，室温下孵育1 min后，以8 000 r/min离心1 min，将纯化的DNA保存在-20℃冰箱中，备用。

1.2.2 CD209 SNP位点CD209、CD209L DNA的扩增 CD209 SNP位点的 PCR 扩增引物和单碱基延伸引物为正向5“-GATTAGCATACTTAGACTACTACCTCCATG-3”和反向5“GATCAACTTCTGAAAAAGCATTCCCAC-3”。 CD209L SNP位点的 PCR扩增引物和单碱基延伸引物为正向5“-ATCGTGACTTAGACTACTACCAAGCT-3”和反向5“GTCGTTCTGAAAAAGCATTCCTTAA-3”。参照Platinum Taq PCR试剂盒(美国Applied Biosystems公司)操作说明进行反应，将96微孔板置于GeneAmp PCR System 9700型酶标仪(美国Applied Biosystems公司)按以下条件进行反应：94℃1 min，然后30个循环95℃30 s，55℃30 s，和72℃ 30 s。

1.2.3 CD209、CD209L单核苷酸多态性检测 将8 μL PCR产物经限制酶过夜消化，采用4%琼脂糖凝胶电泳系统(BMA，Rockland，ME，USA)分析确定CD209、CD209L单核苷酸的多态性。

1.3 统计学处理采用SPSS23.0软件进行统计学分析，多态性位点的基因型与感染风险的关系采用χ2检验，多态性位点的基因型频率与感染风险的关系采用二元Logistic 回归分析，以OR和95%CI表示相对风险度，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 非感染组、感染组HBV阳性孕妇CD209 77、55基因型比例比较与非感染组CD209 77、55基因型比例(42.0%、48.0%)比较，感染组CD209 77、55基因型比例(45.0%、48.2%)升高， 差异无统计学意义(P>0.05)；CD209 77基因型不能增加宫内感染风险，差异无统计学意义(OR=1.055，95CI%=0.759 0～1.466 5，P>0.05),见表1。

2.2 非感染组、感染组HBV阳性孕妇CD209 7、5等位基因频率比较与非感染组CD209 7等位基因型频率(50.0%)比较，感染组CD209 7等位基因型频率(48.3%)降低， 差异无统计学意义(P>0.05)；与非感染组CD209 5等位基因型频率(50.0%)比较，感染组CD209等位基因型频率(51.7%)升高， 差异无统计学意义(P>0.05)；CD209 7等位基因频率不能增加过宫内感染风险，差异无统计学意义(OR=0.968，95CI%=0.745～-1.257，P>0.05)，见表2。

表1 非感染组、感染组HBV阳性孕妇CD209 77、75、55基因型比例比较/例(%)

表2 非感染组、感染组HBV阳性孕妇 CD209 7、5等位基因频率比较/例(%)

2.3 非感染组、感染组HBV阳性孕妇CD209L 77、75、55基因型比例比较与非感染组CD209L 77基因型比例(36.0%)比较，感染组CD209L 77基因型比例(66.7%)升高， 差异有统计学意义(P<0.05)；与非感染组CD209L 55基因型比例(54.0%)比较，感染组CD209L 77基因型比例(18.3%)降低， 差异有统计学意义(P<0.05)；CD209L77基因型能增加过宫内感染风险，差异有统计学意义(OR=1.920，95%CI=1.269～2.904，P<0.05)，见表3。

表3 非感染组、感染组HBV阳性孕妇CD209L 77、75、55基因型比例比较/例(%)

注：与非感染组比较，*P<0.05。

2.4 非感染组、感染组HBV阳性孕妇CD209L 7、5等位基因频率比较与非感染组CD209L 7等位基因频率(40.0%)比较，感染组CD209L 7等位基因频率(73.3%)升高， 差异有统计学意义(P<0.05)；与非感染组CD209L 5等位基因频率(60.0%)比较，感染组CD209L 5等位基因频率(26.7%)降低， 差异有统计学意义(P<0.05)；CD209L 7等位基因频率能增加宫内感染风险，差异有统计学意义(OR=2.25，95%CI=1.606～3.152，P<0.05), 见表4。

表4 非感染组、感染组HBV阳性孕妇CD209L 7、5等位基因频率比较/例(%)

注：与非感染组比较，*P<0.05。

2.5 非感染组、感染组HBV阳性孕妇CD209L 99、97、77基因型比例比较与非感染组CD209L 99基因型比例(48.0%)比较，感染组CD209L 99基因型比例(43.0%)降低， 差异无统计学意义(P>0.05)；与非感染组CD209L 77基因型比例(38.0%)比较，感染组CD209L 77基因型比例(40.0%)升高， 差异无统计学意义(P>0.05)；CD209L 99基因型不能增加宫内感染风险，差异无统计学意义(OR=1.059，95%CI=0.782～1.433，P>0.05)，见表5。

表5 非感染组、感染组HBV阳性孕妇CD209L 99、97、77基因型比例比较/例(%)

2.6 非感染组、感染组HBV阳性孕妇 CD209L 9、7各等位基因频率比较与非感染组CD209L 9等位基因频率(56.0%)比较，感染组CD209L 9等位基因频率(51.7%)降低， 差异无统计学意义(P>0.05)；与非感染组CD209L 7等位基因频率(44.0%)比较，感染组CD209L 7等位基因频率(49.3%)升高， 差异无统计学意义(P>0.05)；CD209L 9等位基因频率不能增加过宫内感染风险，差异无统计学意义(OR=1.103，95%CI=0.860～1.416，P>0.05),见表6。

2.7 非感染组、感染组HBV阳性孕妇CD209L 66、65、55基因型突变型比较与非感染组CD209L 66、55基因型比例(56.0%、30.0%)比较，感染组CD209L 66、55基因型比例(56.6%、30.3%)升高， 差异无统计学意义(P>0.05)；CD209L 66基因型不能增加宫内感染风险，差异无统计学意义(OR=0.957，95%CI=0.819～1.549，P>0.05),见表7。

表6 非感染组、感染组HBV阳性孕妇 CD209L 9、7等位基因频率比较/例(%)

表7 非感染组、感染组HBV阳性孕妇CD209L 66、65、55基因型突变型比较/例(%)

2.8 非感染组、感染组HBV阳性孕妇 CD209L 6、5等位基因频率比较与非感染组CD209L 6、5等位基因频率(68.0%、32.0%)比较，感染组CD209L 77、55等位基因频率(69.0%、35.0%)升高， 差异无统计学意义(P>0.05)；CD209L 6等位基因频率不能增加过宫内感染风险，差异无统计学意义(OR=0.841、95%CI=0.934～1.369，P>0.05),见表8。

表8 非感染组、感染组HBV阳性孕妇 CD209L 6、5等位基因频率比较/例(%)

3 讨论

单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)是人类基因组中最常见的遗传变异形式，其中一部分对人体对疾病易感性有影响，树突状细胞特异性细胞内黏附分子基因多态性在疾病易感性中具有相当大的作用。与构成膜结合模式识别受体的树突状细胞特异性细胞内黏附分子基因家族的其他成员不同，CD209和CD209L主要位于细胞内吞区室； CD209识别病毒衍生的dsRNA以及poly C(1种合成的dsRNA类似物)，CD209L识别细菌和病毒中存在的未甲基化的CpG基序。CD209通过使用含有CD209-IL1R结构域的衔接子诱导干扰素-β(TRIF)通过髓样分化初级应答蛋白88(MyD88)非依赖性途径介导其功能效应，通过诱导干扰素导致抗病毒活性和/或凋亡和caspase招募。而CD209L通过MyD88依赖性途径起作用，导致NF-κB活化，细胞因子分泌和炎症反应[11-13]。

存在于染色体4上的CD209基因的外显子7/5多态性通过改变CD209胞外域和功能而影响受体-配体相互作用。CD209 7/5多态性存在于CD209基因的外显子2中，并且可能影响mRNA水平的表达。CD209通过MyD88依赖性途径起作用，导致NF-κB活化，细胞因子分泌和炎症反应。具有DNA基因组的病毒，例如HBV病毒，可能潜在地激活CD209，其响应于CpG DNA而被激活，以诱导细胞因子表达。有研究评估CD209(7/5)基因多态性与日本、德国、美国HBV孕妇宫内感染易感性之间的关联，CD209(7/5)等位基因频率分别为34.0%、55.4%和57.0%，表明宿主遗传因素在个体间差异与疾病易感性方面的相关性[14-15]，这与本次研究显示CD209 77基因型、 CD209 7等位基因频率不能增加宫内感染风险的结果相一致。

本研究表明，CD209L77基因型、CD209L 7等位基因频率能增加宫内感染风险，说明CD209L 77基因型与HBV宫内感染结局相关[16-17]。该特定CD209L 77基因型在HBV宫内感染中的功能意义的表征可提供导致新型预防和治疗方法的发展的见解。仍需要进一步研究来验证这些发现并进一步探讨HBV宫内感染与易感基因之间的关系，以及可能与HBV宫内感染有关的任何其他风险因素。本研究结果同时也提示CD209、CD209L 9/7、CD209L 6/5等位基因突变与HBV宫内感染无关。