高效液相色谱法测定婴幼儿配方奶粉中维生素A和维生素E的含量

徐 锐，陈 中

(1.华南理工大学 食品科学与工程学院，广东 广州 510640；2.美赞臣营养品(中国)有限公司，广东 广州 510730)

维生素A(vitamin A)又名视黄醇，属于脂溶性生素，维生素A对于婴幼儿的骨骼和视力的生长发育有很大的作用。维生素A不但可以维持正常的视觉功能防止夜盲症，而且还具有维持上皮细胞结构的完整与健康、促进机体正常生长发育、增强机体的造血功能和预防癌症等十分重要的功能[1-2]。维生素E(vitamin E)又名抗不育维生素或生育酚，具有抗不育功能和抗氧化作用[3]。生育酚是人体不可缺少的营养素，其四种异构体的构型与磷脂中多不饱和脂肪酸的构型互补而具有较强的清除氧自由基能力，保护组织完整性，在生命过程中起重要作用。维生素E包括生育酚和三烯生育酚两类共8种化合物，即α、β、γ、δ生育酚和α、β、γ、δ三烯生育酚，其中α-生育酚分布最广、生物活性最高，δ-生育酚抗氧化能力最强。生育酚对人体有重要的生理功能，具有抗氧化、抗衰老、抗不育、调节免疫力等作用，对生殖功能﹑细胞代谢均有影响[3]。维生素A和维生素E是婴幼儿奶粉中一重要营养添加剂，其含量必须经过检测，因此建立维生素A和维生素E的检测方法对监测其含量意义重大。

目前测定奶粉中维生素A和维生素E的方法有紫外分光光度法、薄层层析法、荧光法、气相色谱法和高效液相色谱法[4-9]等，高效液相色谱法(以下简称HPLC法)具有快速、准确、样品前处理简单以及分辨率高等优点，HPLC法分为反相HPLC法和正相HPLC法，国家标准方法GB/T 5009.82-2003[6]、GB 5413.9-2010[7]和GB5009.82-2016[8]属于皂化-反相色谱法，但是反相HPLC法在测定维生素A和维生素E时出峰时间长，分离维生素E的四种异构体时峰型和分离度欠佳，对柱子和柱温要求过高，一般柱子无法分离β-生育酚和γ-生育酚，C30柱又需要控制在柱温20℃，对于一些小的实验室很难满足这个要求。国际标准方法AOAC Offcial Method 2012.10[9](AOAC法)属于直接提取-正相色谱法，AOAC法可以实现维生素A和维生素E四种异构体的完美分离，维生素A和维生素E时出峰时间长，且同时用到紫外检测器和荧光检测器，所以寻求一种的方法去测定维生素A和维生素E四种异构体的含量意义重大，皂化-正相HPLC法综合皂化-反相色谱法和直接提取-正相色谱法的优点可以快速正确测定维生素A和维生素E四种异构体的含量。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

视黄醇标准品和α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚标准品(含量≥95%)，美国Sigma公司；正己烷、四氢呋喃均为色谱纯，J.T.Baker；氢氧化钠、无水乙醇均为分析纯，广州化学试剂；BHT，美国Sigma公司。

Cary 60紫外可见分光光度计：美国Agilent公司；HZS-HA水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；AB304-S型电子天平：瑞士梅特勒一托利多公司；2690型高效液相色谱仪配2487型紫外检测器：美国Waters公司。

1.2 试剂及标准品制备

1.2.1 试剂制备

氢氧化钠溶液(10 mol/L)：称取400 g氢氧化钠用milli-Q水溶解并定容至1 L，有效期三周。

0.1%BHT乙醇溶液(m/v)：称取1 gBHT用乙醇溶解并定容至1 L，有效期一个月。

1.2.2 标准品制备

维生素 A 标准储备液(视黄醇)(0.5 mg/mL)：精确称取25 mg的维生素 A 标准品，用正己烷溶解并定容于 50 mL 棕色容量瓶中，在-20℃下避光保存，效期1个月。临用前将溶液回温至20℃，并进行浓度校正。

维生素 E 标准储备液(α-生育酚)(1.0 mg/mL)：精确称取50 mg的维生素E标准品，用正己烷溶解并定容于 100 mL 棕色容量瓶中。在-20℃下避光保存，有效期6个月。临用前将溶液回温至20℃，并进行浓度校正。

维生素 E 标准储备液(β-生育酚)(1.0 mg/mL)：精确称取50 mg的维生素E标准品，用正己烷溶解并定容于 100 mL 棕色容量瓶中。在-20℃下避光保存，有效期6个月。临用前将溶液回温至20℃，并进行浓度校正。

维生素 E 标准储备液(γ-生育酚)(1.0 mg/mL)：精确称取50 mg的维生素 E标准品，用正己烷溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中。在-20℃下避光保存，有效期6个月。临用前将溶液回温至20℃，并进行浓度校正。

维生素 E 标准储备液(δ-生育酚)(1.0 mg/mL)：精确称取50 mg的维生素E标准品，用正己烷溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中。在-20 ℃下避光保存，有效期6个月。临用前将溶液回温至20℃，并进行浓度校正。

维生素A 和维生素E混合标准溶液中间液：准确吸取维生素A 标准储备溶液1.00 mL和维生素E 标准储备溶液各5.00 mL于同一50 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，此溶液中维生素A 浓度为10.0 μg/mL，维生素E各生育酚浓度为100 μg/mL。在-20℃下避光保存，有效期半个月。维生素A和维生素E标准系列工作溶液：分别准确吸取维生素A和维生素E混合标准溶液中间液0.20、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00 mL于10 mL棕色容量瓶中，用正己烷定容至刻度，该标准系列中维生素A浓度为0.20、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00 μg/mL，维生素E浓度为2.00、5.00、10.0、20.0、40.0、60.0 μg/mL。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备

精确称取2～5 g奶粉样品于150 mL三角瓶中，加入20 mL温水溶解，再30 mL 0.1% BHT乙醇溶液和9 mL10 mol/L氢氧化钠溶液，于60℃水浴锅皂化40 min，转移至250 mL分液漏斗，分别用50 mL正己烷萃取2次，再用mill-Q水水洗至中性，经无水硫酸钠脱水处理，在50℃旋蒸至2 mL左右氮吹至干，用正己烷溶解转移并定容至10 mL棕色容量瓶中，过0.45 μm有机滤膜，上机待测。

1.3.2 色谱条件

流动相A为纯四氢呋喃，流动相B为纯正己烷， 采用等度洗脱，正己烷：四氢呋喃=90:10，α-生育酚的保留时间是2.9 min，β-生育酚的保留时间是3.2 min，γ-生育酚的保留时间是3.6 min，δ-生育酚的保留时间是4.0 min，维生素A的保留时间是7.9 min。流速为 1.5 mL/min，紫外检测波长分别为294 nm和325 nm，柱温40℃，进样量25 μL。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件

本试验的目的是研究高效液相色谱法正相法同时测定奶粉中的维生素A和4种维生素E异构体的含量方法。样品经过皂化、正己烷萃取分离纯化后，用硅胶柱zorbax Rx-SIL直接分离维生素A和4种维生素E异构体。在诸多色谱条件中，流动相的选择是分析方法研发的重点。流动相中四氢呋喃的比例对异构体保留时间有较大影响，当流动相正己烷：四氢呋喃比例为96∶4时，维生素A和4种维生素E异构体分离效果最佳，但是保留时间比较长，优化色谱条件后正己烷：四氢呋喃比例为90∶10，柱温40℃，流速为1.5 mL/min，维生素A和4种维生素E异构体完全分离，5种物质8 min内出峰(见图1示)。

1.α-生育酚;2.β-生育酚;3.γ-生育酚;4.δ-生育酚;5.VA

图1 4种生育酚和维生素A正相高效液相色谱图

Fig.1 High performance liquid chromatography of 4 tocopherols and vitamin A

2.2 方法学验证

2.2.1 线性关系、检测限和定量限

按照1.2.2配置一系列不同质量浓度生育酚和维生素A混合标准工作溶液，进样分析，以目标物的峰面积y为纵坐标，质量浓度x为横坐标制作标准曲线，结果见表1。由表1可以看出，生育酚在2～60μg/mL范围内线性关系良好，维生素A在0.2～60 μg/mL范围内线性关系良好，相关系数R2均大于0.99，满足检测需求。检出限和定量限以向空白样品中逐级降低加标浓度的方法来确定，以色谱峰信噪比(S/N)*3为方法的检出限，信噪比(S/N)*10为定量限。生育酚的检出限为0.07～0.14 mg/kg，生育酚的定量限为0.12～0.4 mg/kg，维生素A的检出限为0.02 mg/kg，维生素A的定量限为0.04 mg/kg。

表1 4种生育酚和维生素A的线性关系、线性范围、相关系数、检出限和定量限

2.2.2 方法重现性、回收率和精密度

取标准溶液(0.2 μg/mL)连续进样5次，计算峰面积之间的RSD%，用来确定仪器精密度。结果显示，维生素A、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚和维生素A的RSD分别为0.81%、0．25%、 0.39%、1.64%、1.44%，均小于3%，重现性良好。用奶粉进行加标回收试验，加不同浓度3个级别的标准，平行2份，因为奶粉中维生素A和维生素E主要是以视黄醇和α-生育酚为主，β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚含量很低，所以加标只加维生素A和α-生育酚，计算方法回收率及精密度。结果显示，在线性范围内，维生素A的回收率范围为84.05%～89.17%，α-生育酚的回收率范围为85.36%～91.29%，在80%～100%范围内；RSD分别为3.27%、3.77%，均在5%范围以内。以上显示，该方法具有良好的重现性和精密度，能够开展奶粉中的维生素A和四种维生素E异构体的含量测定研究。

2.3 样品实测结果

选取2种奶粉样品用高效液相色谱法分别测定2种奶粉的维生素A和4种维生素E异构体含量，平行2份，最终计算出维生素A和维生素E含量，按上述样品处理和色谱方法，测定维生素A和维生素E含量，结果见表2，样品色谱图见图2，结果显示奶粉中4种维生素E异构体的含量以α-生育酚的含量最高，其他3种生育酚含量较低，参考GB5009.82-2016计算方式：维生素E(mg α-TE/100 g)=α-生育酚(mg/100 g)+β-生育酚(mg/100 g)×0.5+γ-生育酚(mg/100 g)×0.1+δ-生育酚(mg/100 g)×0.01。最终维生素A和维生素E的结果均在奶粉样品的标准范围内。

表2 维生素A和维生素E的含量

图2 样品色谱图

Fig.2 Sample chromatogram

奶粉样品1维生素A的标准含量范围是430～990 μg/100 g，奶粉样品1维生素E的标准含量范围是4.98～11.09 mg/100 g，奶粉样品2维生素A的标准含量范围是477～897 μg/100g，奶粉样品2维生素E的标准含量范围是3.22～10.00 mg/100g，从表2结果来看，2个奶粉样品的维生素A和维生素E的结果均在奶粉样品的标准含量范围内。

2.4 样品比对结果

选取1种奶粉样品用本文建立的方法和国标方法(GB5009.82-2016第一法)同时测定该奶粉中的维生素A和4种维生素E异构体含量，平行2份，最终计算出维生素A和维生素E含量，结果见表3。

表3 维生素A和维生素E的含量

从表3结果来看：GB5009.82-2016第一法和本法检测结果差值<5%，无显著差异，本法可以用来检测奶粉中维生素A和维生素E含量。

3 结论

选用Agilent Zorbax RX-SIL柱正相分离维生素A和α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚，以正己烷-四氢呋喃(90∶10)为流动相，等度洗脱，流速1.5 mL/min，在294 nm波长下检测维生素E，在325 nm波长下检测维生素A，分离效果较佳，实际检测奶粉样品，其结果在标准范围内，与国标方法GB5009.82-2016第一法进行方法对比，结果无差异，证明该方法可以快速、准确地测定奶粉中维生素E和维生素A的含量。