苔麸总黄酮提取工艺及体外抗氧化活性研究

贾小茜，杜进民

（河北科技大学 生命科学与工程学院，河北 石家庄 050018）

苔麸（Eragrostis tef）是一种具有40 条染色体的四倍体（2n=4x=40）植物，为一年生禾本科画眉草属作物，又被称为埃塞俄比亚画眉草，原产于埃塞俄比亚，多生长在海拔3 000 m 的高原地带。在埃塞俄比亚，每年大约有300 公顷的耕地用来种植苔麸，粮草兼用[1-3]。因其对环境具有良好的适应性，所以在美国、印度和澳大利亚等国家已大面积种植[4-6]。

关于苔麸的最新研究结果显示，苔麸含有丰富的黄酮类化合物[7-9]，如Shreeya Ravisankar 等通过超高效液相色谱质谱联用分析，从苔麸中共鉴定出26种黄酮类化合物[9]。黄酮类化合物具有多种药理作用和生物活性，如抗肿瘤、保护心脑血管系统和肝脏、延缓衰老抗疲劳、提高免疫力、抗氧化及清除自由基等良好的药理作用和生物活性，因此，黄酮类化合物已经成为近几年的研究热点[10-12]。目前国内对苔麸相关的研究还较少，以苔麸为原料，研究苔麸总黄酮的优化提取工艺，并通过体外试验初步探索苔麸的抗氧化活性，为进一步深入研究和开发利用苔麸提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苔麸：购自埃塞俄比亚；芦丁：南京奥多福尼生物科技有限公司；抗坏血酸：索莱宝生物科技有限公司；过氧化氢：分析纯，天津大茂化学试剂厂；氢氧化钠、氢氧化铝、亚硝酸钠、无水乙醇、过硫酸钾：分析纯，天津永大化学试剂有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）：分析纯，上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-2000 紫外可见分光光度计：尤尼柯上海仪器有限公司；DL-5 低速离心机：上海安亭科学仪器厂；UPR-11-10T 优普系列超纯水器：四川优普超纯科技有限公司；GM-0.33II 隔膜真空泵：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；JJ200 型电子天平：常熟市双杰测试仪器厂；SpectraMax i3 型酶标仪：Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 苔麸总黄酮含量的测定

1.3.1.1 标准曲线的制备

参考文献[13-14]，以芦丁作为标准品，准确称取干燥至恒重的芦丁标准品5 mg，用80%乙醇溶解并定容至10 mL，配制成终浓度为0.5 mg/mL 的芦丁标准品溶液，测定过程如下：

分别取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 芦丁标准品溶液用80%乙醇补至1 mL，不同浓度的芦丁标准品溶液加5%NaNO20.5 mL 摇匀静置6min，加10%Al（OH）30.5 mL 摇匀静置6 min，再加4%NaOH 4 mL，摇匀静置10 min，波长510 nm 测定吸光度。

1.3.1.2 样品总黄酮含量测定

参考文献[15-18]，准确称取1.00 g 苔麸粉，按照一定的料液比加入一定体积分数的乙醇，水浴浸提一定时间，每隔10 min 摇晃均匀，提取后尽快冷却，4 200 r/min，离心15 mim。取上清按照1.3.1.1中方法测定苔麸总黄酮含量。计算公式如下：

式中：A 为样品吸光度；V取为测定所取样品体积，mL；V体为样品总体积，mL。

1.3.2 单因素试验

称取1.00 g 苔麸粉，在其他因素不变的情况下，分别考察乙醇体积分数（60%、70%、80%、90%）、料液比[1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）]、提取时间（20、40、60、80、100 min）、提取温度（40、50、60、65、70、80℃）对苔麸总黄酮提取量的影响。筛选出各个因素影响的最优条件。

1.3.3 响应面设计

根据2.2 单因素试验结果所示，运用Design-Expert8.0.6 软件设计四因素三水平Box-Behnken 响应面试验，分别考察料液比、乙醇体积分数、提取时间、提取温度对苔麸总黄酮提取量的影响并对结果进行分析[19]，因素及水平见表1。

表1 响应面设计因素和水平表Table 1 Response surface design factors and level tables

1.3.4 验证试验

根据响应面最终优化的结果，水浴提取苔麸总黄酮，平行3 次试验，计算苔麸总黄酮提取量，以确定最终的优化结果。验证最优工艺可行性。

1.3.5 抗氧化能力测定

1.3.5.1 ABTS＋·清除能力的测定

500μL ABTS 反应液（140 mmol/L 过硫酸钾 100 mL与 1.76 mL7 mmol/L 混合反应16 h，取 1 mL 定容至50 mL）加入不同体积的样品，用60 %乙醇补齐至650 μL，反应 6 min，在 734 nm 条件下测定吸光度[20]。

计算公式如下：

式中：A2为试验组吸光度；A1为空白组吸光度以等体积60%乙醇代替样品；A3为背景对照组吸光度用等体积去离子水替代ABTS 反应液。

1.3.5.2 羟自由基（·OH）清除能力的测定

100 μL 4 mmol/mL FeSO4加入不同体积样品（样品加去离子水补齐至 400 μL） 和 100 μL 4 mmol/mLH2O2，室温反应 10 min，加入 100 μL 4 mmol/mL 水杨酸 37℃水浴20 min，在510 nm 处测定吸光度[21]。

计算公式如下：

式中：A5为试验组吸光度；A4为空白组吸光度以等体积60%乙醇代替样品；A6背景对照组吸光度用等体积无水乙醇代替水杨酸。

2 结果分析

2.1 标准曲线绘制

标准曲线方程为：Y=1.029X+0.002 7；相关系数R2=0.998 9，标准液的线性范围为0～0.035 mg/mL，线性关系良好。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 乙醇体积分数

固定料液比 1∶10（g/mL），在 60℃条件下水浴浸提60 min，测定乙醇体积分数对苔麸总黄酮提取量的影响，结果见图1。

图1 乙醇体积分数对苔麸总黄酮提取量的影响Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on total flavonoids extraction from Eragrostis tef

如图1所示，随着乙醇体积分数的增加，苔麸总黄酮提取量不断上升，当乙醇体积分数增长到70%时，其总黄酮提取量达到最大，随后，当乙醇体积分数继续增大时，其提取量又降低，这可能是因为随着乙醇含量的增高，水溶性黄酮溶解度降低。因此，以70%乙醇为最佳提取剂。

2.2.2 料液比

固定乙醇体积分数70%，在60℃条件下水浴浸提60 min，测定不同料液比对苔麸总黄酮提取量的影响，结果见图2。

图2 料液比对苔麸总黄酮提取量的影响Fig.2 Effect of the ratio of material to liquid on the extraction of total flavonoids from Eragrostis tef

如图2所示，随着溶剂体积的增加，苔麸总黄酮的提取量不断上升，当料液比变到 1∶15（g/mL）时，其总黄酮提取量达到最大，随后，当溶剂体积继续增大时，其提取量又出现降低的趋势。这可能与随着溶剂体积增多使非黄酮类物质溶解度增大有关。因此，初步选择料液比 1∶15（g/mL）为优。

2.2.3 提取时间

固定料液比 1∶10（g/mL），乙醇体积分数 70%，在60℃条件下水浴浸提不同的时间，测定不同提取时间对苔麸总黄酮提取量的影响，结果见图3。

图3 水浴浸提时间对苔麸总黄酮提取量的影响Fig.3 Effect of water bath extraction time on total flavonoids extraction from Eragrostis tef

如图3所示，随着提取时间的增加，苔麸总黄酮提取量不断上升，当浸提时间为60 min 时，提取量达到最大，当浸提时间继续增大时，其提取量基本不变。因此，选取60 min 为最适提取时间。

2.2.4 提取温度

固定液料比 1∶10（g/mL），乙醇体积分数 70%，水浴浸提60 min，测定不同提取温度对苔麸总黄酮提取量的影响，结果见图4。

图4 水浴浸提温度对苔麸总黄酮含量的影响Fig.4 Effect of water bath extraction temperature on total flavonoids content of Eragrostis tef

如图4所示，随着水浴提取温度的增加，苔麸总黄酮的提取量不断上升，当水浴温度增长到65℃时，其总黄酮提取量达到最大，随后，当水浴温度继续增大时，其提取量又逐渐下降，这可能是因为温度过高使黄酮被氧化或是加快乙醇的挥发从而降低黄酮的溶出率。当温度继续升高时提取量又出现略有上升的趋势，这可能是随温度升高，一些非黄酮类物质溶解度上升对测定的干扰增大，同时考虑到经济成本问题，因此，选用65℃为最适提取温度。

2.3 响应面试验

2.3.1 响应面试验设计

通过用Desert-expert8.0.1 软件设计Box-Behnken响应面优化试验，统计结果如表2所示，得到苔麸总黄酮提取量与乙醇体积分数（A）、料液比（B）、提取时间（C）、提取温度（D）之间的二元多项式模型如下：

响应面试验结果见表2。

模型回归方程方差分析见表3。

表2 响应面优化设计表Table 2 Response surface optimization design table

表3 模型回归方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

续表3 模型回归方程方差分析Continue table 3 Variance analysis of regression equation

通过表3 方差分析可知，其模型P〈0.000 1，说明以响应值显示的模型为极显著，方程的相关系数R2=0.955 6，修正系数AdjR2=0.911 2，说明该方程模型有较高的可信度。失拟项P=0.117 8〉0.05，为不显著，说明该二元多项式拟合较好，试验误差较小。方差分析结果表示一次项 A、B、D，二次项 A2、B2、C2，交互项 AB均对响应值产生极显著的影响（P〈0.01）；各试验因素对苔麸总黄酮提取的影响为D〉A〉B〉C，即提取温度〉乙醇体积分数〉料液比〉提取时间。

2.3.2 响应面图分析及优化

响应面和等高线图见图5～图10。

图5 乙醇体积分数和料液比之间的交互作用Fig.5 Interaction between ethanol volume fraction and solidliquid ratio

图6 乙醇体积分数和提取时间之间的交互作用Fig.6 Interaction between ethanol volume fraction and extraction time

图7 乙醇体积分数和提取温度之间的交互影响Fig.7 Interaction between ethanol volume fraction and extraction temperature

图8 料液比和提取时间之间的交互作用Fig.8 Interaction between solid-liquid ratio and extraction time

图9 料液比和提取温度之间的交互作用Fig.9 Interaction between solid-liquid ratio and extraction temperature

图10 提取时间和提取温度之间的交互作用Fig.10 Interaction between extraction time and extraction temperature

根据模型绘制出乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取温度两两因素之间的等高线和响应面，等高线越接近椭圆说明交互作用越强，响应面越陡峭表面该因素对苔麸总黄酮提取量影响越大，反之曲面越平缓表明其对苔麸总黄酮提取量影响越小，由图5 显示乙醇体积分数和料液比的响应曲面图陡峭，且等高线呈椭圆形，表明其在因素水平变化范围以内响应值具有最大值，两因素之间的交互作用显著，对苔麸总黄酮提取量影响最大，这与表3 分析结果一致。

2.4 验证性工艺

考虑到实际操作问题，将优化结果乙醇体积分数60.08%，提取时间70.81 min，调整为乙醇体积分数60%，料液比 1∶20（g/mL），提取时间 71 min，提取温度80℃，得到苔麸总黄酮提取量为144.0 mg/10 g，接近于预测值145.42 mg/100 g，说明该工艺可行。

2.5 抗氧化能力测定

2.5.1 ABTS+·清除能力测定

苔麸总黄酮提取物对ABTS+·清除能力见图11。

图11 苔麸总黄酮提取物对ABTS+·清除率Fig.11 ABTS+·scavenging rates of total flavonoids extract from Eragrostis tef

如图11所示，以 25 μL/mLVC为对照，随着样品和VC含量的增加，二者对ABTS+·的清除率均呈现逐步增加的趋势，同时显示出样品溶液对ABTS+·的清除率与25 μL/mLVC相当。以接近100%的清除效果来说明苔麸总黄酮具有较好的ABTS+·清除作用。

2.5.2 羟基自由基（·OH）清除能力测定

苔麸总黄酮提取物对羟基自由基（·OH）的清除能力见图12。

图12 苔麸总黄酮提取物对羟基自由基（·OH）的清除Fig.12 Hydroxyl radical（·OH）scavenging rates of total falvonoids from Eragrostis tef

如图12所示，以0.2 mg/mLVC为对照，在样品和VC量均较低时，二者呈现对·OH 较为接近的清除率，随着二者含量的增加，清除率逐渐增强，样品对·OH清除率高于 VC对照组，在 150 μL～200 μL 之间样品和VC对照对·OH 清除率出现交点，随后样品对·OH 清除率低于VC对照组，其原因有待考证。样品对羟自由基清除率最高达57.78 %以说明苔麸总黄酮具有较好的·OH 清除作用。

3 结论

本试验通过水浴浸提法提取苔麸总黄酮并对其抗氧化作用进行初步探讨。在单因素试验基础上，通过Box-Behnken 响应面优化苔麸总黄酮提取工艺。优化结果为乙醇体积分数 60%，料液比 1∶20（g/mL），提取时间71 min，提取温度80℃，在此条件下苔麸总黄酮提取量为144.0 mg/100 g。苔麸总黄酮提取液对ABTS+·和·OH 的清除作用分别达到99.23%和57.78%，表明苔麸总黄酮提取液具有一定的抗氧化活性。苔麸作为一种新兴的全谷物，人们对其关注度越来越高，本试验为苔麸的探索研究及进一步开发利用提供依据。