固相萃取-高效液相色谱法同时测定鸡粪中四环素类、喹诺酮类和磺胺类抗生素

2019-05-29余佩瑶陈传胜刘寒冰邓艳玲薛南冬

色谱 2019年5期

余佩瑶,陈传胜,刘寒冰,邓艳玲,薛南冬*

(1. 中南林业科技大学环境科学与工程学院, 湖南长沙 410004;2. 中国环境科学研究院土壤与固体废物环境研究所, 北京 100012)

抗生素被广泛用于畜禽疾病防治[1],而畜禽摄入的抗生素中约30%～90%不能被吸收,以原药或代谢产物形式随粪便排出体外[2-4]。抗生素随着粪便农用在土壤中累积,通过地表径流和淋滤等作用影响地表水和地下水环境,造成土壤和水环境中抗生素污染,对动植物和微生物产生生态毒理效应,甚至威胁人类健康[5]。已有调查显示,畜禽粪便中存在多种抗生素,四环素类、喹诺酮类和磺胺类抗生素含量最多[6]。中国广东地区猪粪样品中喹诺酮类抗生素含量在0.02～1.52 mg/kg之间,磺胺类抗生素总含量在1.90～13.40 mg/kg之间[7];北京地区采集的鸡粪样品中，四环素类(土霉素、金霉素和四环素)含量最高可达23.43、19.03和14.56 mg/kg[8];华东地区采集的鸡粪样品中，四环素类和磺胺类抗生素含量最高分别达到354.0和7.10 mg/kg[9]。

畜禽粪便中不同种类抗生素的同时分析检测对抗生素污染评估和治理具有重要意义[10]。目前,抗生素检测方法大多针对污水[11-13]、液体食品[14,15]及养殖废水[16]等液体基质,对畜禽粪便中抗生素的检测方法大多研究某一类抗生素[17,18],对不同种类抗生素同时分析检测的方法也大多按抗生素种类建立,需要分类提取检测[19,20],主要采用高效液相色谱-串联质谱法[13,21]及高效液相色谱法。前者灵敏度高,但是对复杂的粪便样品存在较强的基质效应,操作复杂且使用及维护成本高。高效液相色谱能使目标物质较好分离,且降低了分析成本。因此,建立畜禽粪便中多种类抗生素同时检测的高效、快速和低成本方法尤为重要。

本研究对固相萃取和高效液相色谱检测步骤中的相关参数进行了优化,建立了高效、低成本的固相萃取-高效液相色谱法,对畜禽粪便中常见的6种抗生素进行同时提取检测。6种抗生素包括常见的四环素类(土霉素,oxytetracycline, OTC;四环素,tetracycline, TCT)、喹诺酮类(诺氟沙星,norfloxacin, NOR;恩诺沙星,enrofloxacin, ENR)和磺胺类抗生素(磺胺二甲嘧啶,sulfamethazine, SMZ;磺胺甲恶唑, sulfamethoxazole, SMX)。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC-20AT高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司); Waters Xterra RP18色谱柱(250 mm×4.6 μm, 5 μm)(美国Waters公司); Oasis HLB柱(3 mL/60 mg)(美国Waters公司); Visiprep TM-DL固相萃取装置(美国Supelco公司); HITACHICR21GⅡ高速离心机(日本HITACHI公司); DELTA320 pH计(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司); CM-12水浴氮吹仪(北京成荫伟业科技有限公司);冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)。

标准品:OTC、TCT、ENR、NOR、SMZ和SMX纯度均≥99%(百灵威公司)。甲醇(methanol, MeOH)、乙腈(acetonitrile, ACN)、丙酮(acetone, ACE)和二氯甲烷(dichloromethane, DCM)均为色谱纯(上海安谱实验科技股份有限公司)。分析纯磷酸、柠檬酸、无水磷酸氢二钠、EDTA-Na、乙酸(acetic acid)(上海安谱实验科技股份有限公司)。实验所用空白鸡粪收集于河南某小型养鸡场,调查显示养鸡场未施用过抗生素,实验室分析结果也表明该鸡粪样品不含OTC、TCT、ENR、NOR、SMZ和SMX等目标抗生素。实际样品收集自辽宁省抚顺市某小型养鸡场。鸡粪冷冻干燥,研磨,过1 mm筛待用。

准确称取6种抗生素标准品各100.00 mg,用甲醇溶解于100 mL棕色容量瓶中,配成质量浓度为1 g/L的抗生素标准储备液,4 ℃冷藏保存。取配制好的标准储备液各0.1 mL,用10 mL棕色容量瓶配制100 mg/L的混合标准液,并稀释成50.0、10.0、5.0、1.0、0.5 mg/L的抗生素标准混合溶液。

1.2 样品处理

准确称取过筛的鸡粪样品0.50 g,置于50 mL离心管中,加入提取剂EDTA-McIlvaine和有机混合提取液(甲醇-乙腈-丙酮,2∶2∶1, v/v/v)各2.5 mL,涡旋混匀30 s, 30 ℃下超声15 min,在8 000 r/min下离心15 min,取上层清液于50 mL离心管中,重复以上步骤3次,合并3次提取液,将液体在40 ℃水浴条件下浓缩至5 mL,用超纯水定容到10 mL,以降低有机溶剂浓度[21]。过0.45 μm有机滤膜,准备过HLB固相萃取柱进行净化。

HLB固相萃取柱使用前依次用5 mL甲醇和5 mL超纯水活化,保持柱床湿润,将浓缩液以1 mL/min的流速过柱,用5 mL 5%(v/v)甲醇水溶液淋洗小柱并真空抽干5 min,最后用5 mL甲醇-二氯甲烷(7∶3, v/v)溶液洗脱,收集洗脱液,在40 ℃水浴条件下氮吹至近干,用乙腈-0.7%磷酸(1/9, v/v)定容至1 mL,过0.22 μm有机滤膜待测。

1.3 色谱条件

Waters Xterra RP18色谱柱(250 mm×4.6 μm, 5 μm);柱温32 ℃;二级阵列管检测波长为270 nm;进样体积为10 μL;流速为0.8 mL/min;二元梯度洗脱,流动相A为乙腈,流动相B为0.7%(v/v)磷酸溶液。洗脱程序为:0～20 min, 10%B; 20～35 min, 10%B～18%B; 35～40 min, 18%B～10%B; 40～50 min, 10%B。

2 结果与讨论

2.1 提取方法

2.1.1提取剂的选择

抗生素提取剂很多。甲醇、乙腈等有机溶剂因极性相似，可得到较大分配系数，被广泛应用于液体中喹诺酮类和磺胺类抗生素的提取[20]。EDTA-McIlvaine缓冲液是常见的鸡粪中四环素类抗生素提取剂[22],可与四环素类抗生素产生竞争,有效减少鸡粪中金属离子与四环素类抗生素中N、O官能团的螯合[23]。针对抗生素的不同性质采用不同提取剂,是提高提取效率的关键。为了选择一种对6种抗生素的同时提取效果最佳的提取剂,本文选择了不同提取剂M1(EDTA-McIlvaine)[22]、M2(甲醇-乙腈-丙酮,2∶2∶1, v/v/v)[22,24]、M3(乙腈-乙酸,125∶1, v/v)[19]、M4(M1-M3, 1∶1, v/v)和M5(M1-M2, 1∶1, v/v)。加标水平为10 μg/g,平行3次,比较不同提取剂单独及等比例混合使用时各抗生素的回收率(见图1)。可以看出,单纯以EDTA-McIlvaine缓冲液(M1)或者有机溶剂(M2、M3)作为提取剂时,各类抗生素的提取效率都较低,回收率为21.0%～107.5%、20.7%～69.6%和22.1%～87.8%,说明单独的无机溶剂或者有机溶剂只能提取鸡粪中的小部分抗生素。在M1中加入等体积的酸化乙腈(M4)和有机混合溶液(M5)后,各抗生素的回收率得到改善。比较M4和M5发现,M4虽然整体效果强于M1、M2和M3,但是对于磺胺类抗生素(SMZ、SMX)的提取效果较低,说明加入酸化乙腈只能轻微改变提取剂对磺胺类抗生素的提取效果。而加入有机混合溶液后,M5对各抗生素的提取效果均强于M4,回收率达到70.0%～116.3%之间。这说明单纯以EDTA-McIlvaine缓冲液和一种有机溶剂混合并不能同时对多种抗生素达到较好的提取效果,提取剂中多种成分更有利于将鸡粪中不同形态的抗生素提取出来[25]。所以选择M5为提取剂。

图 1 不同提取剂下6种抗生素的回收率(n=3)Fig. 1 Recoveries of the six antibiotics withdifferent extractants (n=3)

图 2 不同pH值下6种抗生素的回收率Fig. 2 Recoveries of the six antibiotics with different pH

2.1.2pH值对固相萃取效果的影响

在固相萃取过程中,目标物离子化程度影响吸附剂的吸附效率,而目标物离子化程度则与pH值有关。本研究用HCl和NaOH调节M5提取液的pH值,比较酸性及中性条件下不同pH值(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0)对6种抗生素添加回收率的影响(见图2)。加标水平为10 μg/g,不同pH的提取剂提取加标样品后,过HLB固相萃取柱净化,以5 mL甲醇洗脱,平行3次。如图2所示,pH为1～4时,抗生素回收率相差不大;仅pH=3时,目标物回收率略有升高;当提取剂pH为5时,6种抗生素回收率达到最高;pH为5～7时,抗生素的回收率随pH的增大呈下降趋势。样品溶液的pH值影响样品中分析物的化学形式、稳定性以及分析物与固相萃取柱填料之间的相互作用。研究[26]发现,不带电荷的分析物与HLB固相萃取柱填料之间的作用力更强。磺胺类抗生素(pKa1=1.11～2.75, pKa2=4.18～7.59)[27]有芳香第一胺和磺酰胺基,是具有弱碱性和酸性的两性电解质，在pH=2～5时为中性。喹诺酮类抗生素结构中含哌嗪基,有2个pKa值(pKa1=5.5～6.3, pKa2=7.6～8.5)[28],四环素类抗生素同样有2个pKa值(pKa1=3.02～3.30, pKa2=7.40～7.97)[29]。喹诺酮类抗生素和四环素类抗生素在强酸性条件(pH=1～3)下以阳离子形式为主,回收率较低。在弱酸性条件下(pH=5), 6种目标抗生素均以中性分子为主[30],更有利于达到最佳回收效果。

2.2 固相萃取

2.2.1淋洗液的优化

鸡粪组成复杂,经提取剂提取后,提取液中含有较多杂质。因此,需要选择合适的淋洗液,洗掉附在柱上的杂质又不影响目标抗生素的回收。抗生素固相萃取中常用甲醇水溶液作为淋洗液,为了选出合适的淋洗液,比较了不同比例的甲醇水溶液淋洗下抗生素的加标回收率。将抗生素混合标准溶液添加到0.50 g鸡粪样品中,加标水平为10 μg/g,提取步骤同2.1节,浓缩过膜后的提取液通过HLB固相萃取柱,分别用5 mL不同体积分数(0%、5%、15%、25%)的甲醇水溶液淋洗,抽干5 min后用5 mL甲醇洗脱。如表1所示,15%和25%甲醇水淋洗时,有部分抗生素被洗脱,回收率低于60%;随着甲醇体积分数的降低,抗生素回收率逐渐升高;用纯水和5%甲醇水溶液淋洗时,各抗生素回收率相差不大。但是纯水淋洗后,经HLPC检测杂质峰过多,影响目标物的响应值,因此选择用5%甲醇水溶液淋洗。

表 1 不同体积分数的甲醇水溶液淋洗后6种抗生素的

图 3 不同洗脱剂对鸡粪中6种抗生素的洗脱效果(n=3)Fig. 3 Effect of different eluents on the elution efficiencies of the six antibiotics in chicken manure (n=3)

2.2.2洗脱剂的优化

使用HLB固相萃取柱萃取,柱内吸附填料是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物,具有亲水性和疏水性基团,通过亲水或疏水相互作用力,可以保留多种极性差异较大的化合物,常用于抗生素固相萃取[31]。为了从HLB固相萃取柱上洗脱被吸附的化合物,本文比较了E1(甲醇-乙腈,7∶3, v/v)、E2(甲醇)和E3(甲醇-二氯甲烷,5∶5, v/v)3种有机溶剂的洗脱效果,平行3次。在0.50 g鸡粪样品中加入混合标准品溶液(10 μg/g),提取步骤同2.1节,洗脱剂均为5 mL。结果表明,甲醇中加入等体积二氯甲烷可以提高6种抗生素的洗脱效果,回收率高于纯甲醇的0.3%～21.3%(OTC除外)(见图3)。在甲醇中加入不同体积的二氯甲烷,发现当甲醇和二氯甲烷以体积比为7∶3时,各抗生素洗脱效果达到最好,尤其提高了NOR和TCT的回收率,6种抗生素回收率达到70.0%～116.3%(见表2),高于纯甲醇的3.3%～21.6%。因此选择甲醇-二氯甲烷(7∶3, v/v)作为固相萃取的洗脱溶剂。

表 2 不同体积比的甲醇-二氯甲烷对6种抗生素回收率的影响

2.3 色谱条件

2.3.1流动相的选择

高效液相色谱测定多种抗生素时,调节流动相的pH值可以抑制弱碱的解离,进而改变组分的保留时间,改善其分离度。调节流动相pH值常用甲酸、乙酸、磷酸和草酸[11,26],本研究分别用0.1%(v/v)的甲酸水溶液与乙腈(MP1)、0.7%(v/v)磷酸水溶液与乙腈(MP2)作为流动相,同时测定6种抗生素。结果发现,用MP1作为流动相等浓度洗脱,OTC和TCT重合;而采用梯度洗脱时发现,SMX拖尾严重,6种抗生素分离效果不好。选用MP2作为流动相梯度洗脱,可以获得良好的分离效果和适宜的保留时间,峰形尖锐,对称性较好,无拖尾现象,6种抗生素在30 min内可以获得较好的分离。

2.3.2柱温的选择

色谱柱温度会影响目标分析物的出峰时间及分离效果。温度升高可以使流动相扩散能力增强,加快了流动相的层流和分析物分子的混合,能有效调节柱效。本文研究了30～40 ℃时6种抗生素的分离情况,研究表明,柱温升高可以明显加快各抗生素的出峰时间,改善峰形,因为随着温度升高,溶质的容量因子减小,其减小的程度与溶质的焓变有关,焓变越大,温度对保留的影响越大[32]。当温度为40 ℃时,目标物出峰时间快,峰形较好,但SMX和ENR出现峰交叉,分离度较差(见图4a);随着温度降低,SMX和ENR开始逐渐分离,目标物出峰时间也相应减慢;到32 ℃时,6种抗生素得到最好的分离效果,且出峰时间稳定在30 min以内(见图4b),在批量实验时可以减少分析时间。

图 4 不同柱温下6种抗生素的标准溶液色谱图Fig. 4 Chromatograms of the standard solution of thesix antibiotics at different column temperaturea. 40 ℃; b. 32 ℃

2.4 线性范围与检出限

配制0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 mg/L的系列混合标准溶液,按照前述的色谱条件进行检测,以色谱峰面积(y)对抗生素质量浓度(x, mg/L)作校正曲线后,得到线性回归方程和相关系数(r2)。采用3倍信噪比得出检出限(LOD), 10倍信噪比得出定量限(LOQ)[25]。结果见表3,6种抗生素在0.5～100 mg/L范围内具有良好的线性,其r2均≥0.999 9。

2.5 添加回收率及相对标准偏差

分别在0.50 g鸡粪样品中加入5、10、50 μg/g的混合标准溶液,混好的样品在黑暗条件下静置24 h,使二者充分接触,尽量模拟真实样品。每个添加水平重复3次,按优化后的提取方法和色谱条件进行试验,计算各目标抗生素的添加回收率和相对标准偏差。结果表明,该方法在低、中、高3个添加水平下的回收率达到70.0%～116.3%之间(见表3),相对标准偏差为1.2%～16.6%。

表 3 6种抗生素的添加回收率、相对标准偏差(n=3)、回归方程、相关系数、检出限和定量限

y: peak area;x: mass concentration, mg/L

2.6 实际样品的检测

按照上述分析方法对辽宁省抚顺市某养鸡场鸡粪样品中的6种抗生素含量进行了检测。通过多点取样,采集该养鸡场当天新鲜鸡粪样品5份,冷冻干燥,研磨过筛后按照上述预处理提取和检测方法进行分析。结果表明,鸡粪样品中喹诺酮类和磺胺类抗生素均被检出。喹诺酮类抗生素因半衰期较长总含量最高,达到1.57～16.92 mg/kg。NOR和ENR均被检出,含量分别为未检出～9.23 mg/kg和1.57～7.69 mg/kg。磺胺类抗生素总含量在2.02～13.05 mg/kg之间,其中SMZ的含量为2.02～13.05 mg/kg。SMX、OTC和TCT未检出。