石墨烯-管尖固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定贝类中10种脂溶性贝类毒素

杨 霄,黄华伟,伍远安,万译文,李小玲,黄向荣*

(1. 湖南省水产科学研究所, 湖南 长沙 410153; 2. 水产高效健康生产湖南省协同创新中心,湖南 常德 415000; 3. 农业部渔业产品质量监督检验测试中心(长沙), 湖南 长沙 410153)

贝类毒素(海洋生物毒素)特指主要由海洋有毒微藻或微生物产生,能够在海洋生物尤其是双壳贝类中富集的、对其他生物包括人类产生危害的一大类小分子有毒化合物[1]。贝类毒素是目前已知的最毒的一类有机化合物之一,人误食了含有毒素的贝类后会有一定的健康风险,由这些海洋生物毒素引起的疾病包括头痛、呕吐和腹泻,严重时可导致死亡。贝类毒素根据其溶解性可分为水溶性贝类毒素和脂溶性贝类毒素。脂溶性贝类毒素是指一些含有聚醚类结构,具有热稳定性,易溶解于甲醇、乙醚等非极性有机溶剂的微藻毒素。目前常见的脂溶性贝类毒素主要有米氏裸甲藻贝毒素(gymnodimine, GYM)、螺环内酯毒素(spirolides, SPX1)、蛤毒素(pectenotoxin, PTX2)、原多甲藻酸毒素(azaspiracids, AZA1、AZA2、AZA3)、大田软海绵酸(okadaicacid, OA)及其衍生物鳍藻毒素(dinophysistoxins, DTX1、DTX2)、虾夷扇贝毒素(yessotoxin, YTX)等。欧盟对贝肉中部分毒素的安全限量如下:OA、PTX和AZA均为160 μg/kg, YTX为1.0 mg/kg, GYM、SPX等环亚胺类毒素还未设定安全限量[2]。脂溶性贝类毒素具有脂溶性特征,容易在贝类体内长期累积,且其毒性大,中毒后反应快,无适宜的解毒剂,不仅严重威胁着消费者的身体健康和生命安全,同时也严重制约着水产养殖业的健康可持续发展,因而受到国际社会的重点关注[3]。

传统的贝类毒素检测方法为小老鼠生物分析法(MBA法),但因其不能判定多种毒素的具体组分,且灵敏度和准确度均欠佳,已被欧盟于2012年采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法(EN 16204-2012)替代。LC-MS/MS法具有灵敏度高、特异性强的特点,虽然使用该方法检测贝类毒素的研究在我国起步较晚,但发展最为迅速,目前采用LC-MS/MS法一次性分离多种贝类毒素已经成为该领域的研究热点[3-10]。

贝类产品基质较为复杂,样品前处理过程中必须充分地减少基质对目标物测定的干扰,国内已有的研究报道多采用功能性聚合物等吸附剂填充的固相萃取柱[3-7]或基质分散固相萃取技术进行样品前处理过程中的富集和净化[8-10]。固相萃取技术(solid-phase extraction, SPE)是一种常用于样品前处理领域的经典萃取技术[11,12]。但传统的SPE仍存在一些不足之处,如萃取过程繁杂耗时,萃取装置、耗材成本高,制备流程复杂,吸附剂填料选择范围小,因此,开发更优异的样品前处理技术或改进传统SPE技术对贝类样品中贝类毒素的灵敏、快速、低成本检测显得尤为重要。

石墨烯(graphene)是2004年英国曼彻斯特大学物理和天文学系的Novoselov和Geim等[13]发现的一种新型二维平面碳纳米材料。由于其具有大的比表面积、大的共轭体系、很强的疏水性和化学稳定性等特点,石墨烯在电子、信息、能源、材料、催化、吸附和生物医药等领域具有潜在的应用价值[14,15]。石墨烯作为一种新型的吸附材料,目前已经在固相萃取、固相微萃取、磁性固相萃取、分散固相萃取、基质固相分散萃取、微型化固相萃取等样品前处理领域得到较为广泛的关注和应用[15-18]。

样品前处理技术的趋势之一是装置的小型化[19]。管尖固相萃取是一种小型化的样品前处理技术,具有吸附剂和有机溶剂用量少、操作简便快速等优点。由于其具有大的比表面积、高的吸附容量等特点,石墨烯是一种理想的可用于制作小型化固相萃取装置的吸附材料[20]。石墨烯-管尖固相萃取技术将石墨烯和管尖固相萃取各自的优点相结合,在样品前处理领域具有良好的研究价值和应用前景。目前,该技术已成功应用于环境水样[20]、牛奶[21]、果汁[22]、贝类产品[23]、豆芽[24]、减肥补充剂[25]、人血浆[26]等复杂基质样品中目标化合物的分析检测。

本实验制作了设计简单、环保、低成本的石墨烯-管尖固相萃取(graphene-based pipette tip solid-phase extraction, G-PT-SPE)装置,并将其应用于贝类产品前处理的富集和净化过程,结合LC-MS/MS技术,建立了一种简单、快速测定贝类产品中10种脂溶性贝类毒素的方法。实验对提取剂、石墨烯的用量、淋洗剂的种类和用量、洗脱剂的种类和用量等实验参数进行了优化。在最优的实验条件下,将建立的新方法成功应用于实际贝类样品的分离检测,取得了满意的结果。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TSQ Quantum Access液相色谱-串联质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司);超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司);高速冷冻离心机(日本日立公司);漩涡振荡器(美国Fisher公司);氮吹仪(美国Organomation公司);中沃超纯水仪(中沃水务环保科技有限公司)。

GYM(CRM-GYM-b,(2.50±0.13) μg/mL)、SPX1(CRM-SPX1,(7.0±0.4) μg/mL)、PTX2(CRM-PTX2-b,(4.40±0.13) μg/mL)、OA(CRM-OA-d,(8.4±0.4) μg/mL)、DTX1(CRM-DTX1-b,(8.52±0.66) μg/mL)、DTX2(CRM-DTX2-b,(3.8±0.2) μg/mL)、AZA1(CRM-AZA1-b,(1.30±0.07) μg/mL)、AZA2(CRM-AZA2-b,(1.22±0.06) μg/mL)、AZA3(CRM-AZA3,(1.04±0.04) μg/mL)、YTX(CRM-YTX-c,(4.92±0.23) μg/mL) 标准溶液均购自加拿大海洋生物科学研究所(NRC);甲醇、乙腈、正己烷(色谱纯,德国Merck公司);甲酸(LC-MS级,美国Sigma公司);实验用水为超纯水(18.2 MΩ·cm);石墨烯(厚度:约1 nm,片径:1～100 μm)购自南京吉仓纳米科技有限公司。

贝类样品主要包括僧帽牡蛎(Saccostreacucullata)、紫贻贝(Mytilusedulis)和毛蚶(Scapharcasubcrenata),于2017年6月到9月采自福建省福州、漳州、厦门的贝类养殖户和水产品市场。贝类样品运至实验室后用水洗净,开壳取其贝肉,沥干水分,匀浆,于-18 ℃冷冻保存。

1.2 标准溶液的配制

准确移取适量的10种贝类毒素标准溶液,用甲醇稀释配制成混合标准溶液,其中OA、DTX1、DTX2、YTX的质量浓度为0.5 mg/L, PTX2的质量浓度为0.25 mg/L, GYM、SPX1、AZA1、AZA2、AZA3的质量浓度为0.125 mg/L。

1.3 样品处理

1.3.1提取

称取2.0 g (±0.02 g)样品于50 mL离心管中,加入5 mL甲醇,涡旋混匀1 min,超声提取5 min, 8 000 r/min离心5 min,将上清液转移至另一个50 mL离心管中。向下层残渣中加入5 mL甲醇重复提取一次,合并上清液。在提取液中加入甲醇饱和的正己烷5 mL,涡旋混匀1 min,静置分层弃去正己烷层。于40～50 ℃下氮吹至约0.5 mL,加入2.5 mL水涡旋混匀,超声1 min, 12 000 r/min离心5 min,待净化。

1.3.2G-PT-SPE装置组装及SPE净化过程

取200 μL、1 mL移液枪头各一个,用甲醇和水洗涤干净后于室温下晾干。根据200 μL移液枪头的形状特点在枪头末端一固定的位置填充适量的脱脂棉,称取2.0 mg石墨烯粉末填装到200 μL枪头中,再往枪头石墨烯层上端填充适量的脱脂棉。然后根据1 mL移液枪头的形状特点在枪头下端一固定位置切去一段并将其插入到上述200 μL枪头上端即组装成G-PT-SPE装置。依次用1 mL甲醇和1 mL水预处理小柱,然后加入提取液,再用1 mL 10%(v/v)的甲醇水溶液淋洗,最后用1 mL 1%(v/v)氨水甲醇溶液洗脱,收集洗脱液,用甲醇定容至1 mL,过0.22 μm滤膜,滤液供LC-MS/MS测定。

1.4 空白基质标准曲线的绘制

取空白基质样品,按1.3节的样品前处理方法制备空白基质溶液,添加适量1.2节中配制的混合标准溶液,配制成OA、DTX1、DTX2、YTX的质量浓度为2、10、20、100、200 μg/L, PTX2的质量浓度为1、5、10、50、100 μg/L, GYM、SPX1、AZA1、AZA2、AZA3的质量浓度为0.5、2.5、5、25、50 μg/L的基质标准系列工作溶液,并分别上机进行测定。以被测组分的峰面积y为纵坐标,质量浓度x(μg/L)为横坐标,绘制空白基质标准曲线。

1.5 色谱-质谱条件

1.5.1色谱条件

Kinetex XB-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm);柱温30 ℃;流速0.3 mL/min;进样量10 μL;流动相A为水溶液,B为乙腈-水溶液(95∶5, v/v),两者均含有0.19%(v/v)甲酸和2 mmol/L甲酸铵;梯度洗脱程序:0～7.0 min, 20%B～90%B; 7.0～10.0 min, 90%B; 10.0～12.0 min, 20%B。

1.5.2质谱条件

电喷雾离子源(ESI),选择反应监测(SRM);喷雾电压:正离子3 500 V,负离子-3 000 V;离子传输毛细管温度为350 ℃;蒸发温度为320 ℃;鞘气压力为40 arb,辅助气压力为10 arb,碰撞气压力199.983 mPa (1.5 mtorr)。优化后的其他质谱采集参数见表1。

2 结果与讨论

2.1 LC-MS/MS条件的确定

2.1.1质谱条件的优化

采用注射泵直接进样的方式,以10 μL/min的流速,将1.2节配制的GYM、SPX1、PTX2、AZA1、AZA2、AZA3、OA、DTX1、DTX2、YTX混合标准溶液注入离子源中。分别在正负离子模式下对化合物进行一级质谱扫描,发现GYM、SPX1、PTX2、AZA1、AZA2、AZA3在正离子模式下质谱信号强,OA、DTX1、DTX2、YTX在负离子模式下质谱信号强。利用一级质谱扫描分析目标化合物的分子离子峰,选取各化合物灵敏度高、稳定性好的离子为母离子,优化喷雾电压、鞘气压力、辅助气压力、离子传输毛细管温度等参数。然后利用二级质谱全扫描收集各组分母离子对应的子离子信息,分别从中选取相对丰度最强和次强的子离子作为各自的定量离子和定性离子,并优化碰撞能。最终确定1.5.2节所述的质谱条件。

表 1 10种贝类毒素的质谱分析参数

* Quantitative ion.

2.1.2色谱条件的确定

色谱条件参考文献[3,4]确定。在1.5.1节条件下,10种毒素可在12 min内出峰,分析时间短,且峰形尖锐,具有较高的灵敏度和分离度(见图1)。

图 1 10种贝类毒素的SRM色谱图Fig. 1 SRM chromatograms of the ten shellfish toxins SRM: selected reaction monitoring. LC conditions: Kinetex XB-C18 column (100 mm×2.1 mm, 2.6 μm); mobile phases: water (A) and acetonitrile (B) both containing 2 mmol/L ammonium formate and 0.19% (v/v) formic acid. Gradient program: 0-7.0 min, 20%B-90%B; 7.0-10.0 min, 90%B; 10.0-12.0 min, 20%B. Flow rate: 0.3 mL/min. Column temperature: 30 ℃. Injection volume: 10 μL.

2.2 样品前处理方法的优化

2.2.1提取剂的选择

分别考察了甲醇、80%(v/v)甲醇水溶液提取贝类样品中贝类毒素的提取效率。结果发现,在空白牡蛎中添加同一水平的毒素后,80%甲醇水溶液对GYM、SPX1、PTX2、AZA1、AZA2、AZA3、OA、DTX1、DTX2提取的回收率较高,均大于70%,对YTX提取回收率很低,低于60%,不能满足10种毒素同时分析测定的要求,而甲醇对10种毒素提取的回收率均大于75%,同时考虑到甲醇的挥发速率大于80%(v/v)甲醇水溶液,氮吹时较易浓缩,故本实验选用甲醇为提取剂。

2.2.2G-PT-SPE条件的优化

贝类样品基质复杂,贝肉中含有大量的蛋白质、脂肪、糖类等物质,故需要对甲醇粗提液进行净化处理。石墨烯具有大的比表面积、独特的化学特性以及大的吸附容量,可以对贝类样品中的目标组分进行较好的富集和净化。本研究采用正己烷对甲醇提取液进行初步去脂和实验室自制的G-PT-SPE装置对提取液进行固相萃取,为了获得较高的萃取回收率,实验对石墨烯的用量、淋洗剂的种类和用量、洗脱剂的种类和用量进行了优化。

2.2.2.1石墨烯的用量

实验考察了不同用量的石墨烯对10种毒素的萃取效率的影响。结果如图2所示,当石墨烯的用量从0.5 mg增加到2.0 mg时,各组分回收率都有明显增大;继续增加石墨烯的用量,各组分回收率无明显变化,甚至稍有下降。因此,选择2.0 mg石墨烯作为最佳的吸附剂用量。

图 2 石墨烯用量对10种贝类毒素回收率的影响(n=3)Fig. 2 Effect of the amount of graphene on the recoveries of the ten shellfish toxins (n=3)

图 3 淋洗剂对10种贝类毒素回收率的影响(n=3)Fig. 3 Effect of washing solvents on the recoveries of the ten shellfish toxins (n=3)

2.2.2.2淋洗剂的种类和用量

固相萃取的淋洗步骤可以有效地去除样品粗提液中共吸附的干扰杂质。合适的淋洗剂必须在净化样品提取液的同时尽可能地减少目标组分的损失以获得较高的回收率。本实验考察了不同种类淋洗剂对目标物回收率的影响。实验中我们选取甲醇、甲醇-水(1∶1, v/v)溶液、甲醇-水(1∶4, v/v)溶液、甲醇-水(1∶9, v/v)溶液以及水作为淋洗剂,考察其对目标组分的提取回收率的影响,实验结果见图3。从图3中可以看出,甲醇和甲醇-水(1∶1, v/v)溶液作为淋洗剂会造成所有目标组分很大程度的损失,甲醇-水(1∶4, v/v)溶液作为淋洗剂时各目标组分都有一定程度的损失,而甲醇-水(1∶9, v/v)溶液和水作为淋洗剂所有目标物均可获得较高的回收率。考虑到甲醇-水(1∶9, v/v)溶液作为淋洗剂比水的净化效果更好,最终选择甲醇-水(1∶9, v/v)溶液作为淋洗剂。同时还考察了甲醇-水(1∶9, v/v)溶液的用量(0.5～2.0 mL)对目标物回收率的影响,结果显示,当淋洗剂的体积从0.5 mL增加到1.0 mL时,目标物的回收率保持稳定;当淋洗剂的体积从1.0 mL增加到2.0 mL时,目标物的回收率有不同程度的降低。因此,最终选择1.0 mL的甲醇-水(1∶9, v/v)溶液作为淋洗剂。

2.2.2.3洗脱剂的种类和用量

选择合适的洗脱剂将目标物从吸附剂上洗脱下来是整个萃取过程的关键。贝类毒素在石墨烯吸附剂上的保留能力与毒素的亲脂特性、极性以及所带电荷状态有关,因此洗脱剂的酸碱性对毒素在固相萃取柱上的洗脱效果至关重要[23]。贝类毒素固相萃取常用的洗脱剂为不同pH条件的甲醇溶液,本实验重点考察了1%(v/v)的甲酸甲醇溶液、甲醇以及1%(v/v)的氨水甲醇溶液作为洗脱剂时对毒素回收率的影响,结果见图4。从图4中可以看出,GYM、SPX1、PTX2、AZA1、AZA2、AZA3在碱性条件的洗脱效果(回收率为85%～90%)明显优于酸性和中性条件(回收率为75%～83%), OA、DTX1、DTX2在酸性、中性和碱性条件下均具有较好的洗脱效果,回收率为79%～85%, YTX在酸性条件下回收率不足60%,洗脱效果很差,而在碱性条件下回收率接近80%。因此,基于碱性条件下10种贝类毒素均具有较好的洗脱效果,本实验选择1%(v/v)的氨水甲醇溶液作为洗脱剂。为确保分析物被洗脱完全且不浪费洗脱剂,实验对洗脱剂的体积进行了优化,发现1.0 mL的洗脱剂即可将10种毒素洗脱完全。因此,选择1.0 mL 1%(v/v)的氨水甲醇溶液作为洗脱剂。

2.3 方法学验证

2.3.1线性范围和灵敏度

为了降低基质效应对贝类毒素定量造成的误差,本实验按照1.4节的方法制作基质标准曲线。采用在空白样品中添加低浓度目标组分的方法,以信噪比(S/N)=3和S/N=10分别确定各毒素的检出限(LOD)和定量限(LOQ)。10种贝类毒素的线性范围、基质标准曲线、相关系数、检出限和定量限见表2。由表2可知,10种贝类毒素的线性关系良好,灵敏度较高,说明本方法适用于10种贝类毒素的定量分析。

图 4 洗脱剂对10种贝类毒素回收率的影响(n=3)Fig. 4 Effect of elution solvents on the recoveries ofthe ten shellfish toxins (n=3)

2.3.2准确度和精密度

选取阴性牡蛎作为空白基质样品,分别添加3个浓度水平的贝类毒素混合标准溶液,每个浓度水平做6个平行样,按本方法进行准确度和精密度实验,结果如表3所示,10种贝类毒素的回收率为72.0%～101.2%,相对标准偏差为3.63%～14.1%,表明该方法的准确度高,重复性好,满足毒素的日常检测要求。

表 2 10种贝类毒素的线性范围、基质标准曲线、相关系数、检出限和定量限

表 3 (续)

2.4 贝类样品的污染状况调查

采用所建立的方法对78个贝类样品进行分析检测,发现2个阳性样品,其中一份僧帽牡蛎检出GYM,含量为2.36 μg/kg;一份紫贻贝同时检出SPX和YTX,含量分别为5.10 μg/kg和16.3 μg/kg,均低于欧盟限量要求。

3 结论

本文以商品化的石墨烯材料作为固相萃取吸附剂,设计制作了经济、高效的石墨烯-管尖固相萃取装置,并进一步研究了其对贝类样品中10种脂溶性贝类毒素的萃取吸附性能。在优化了石墨烯用量、淋洗剂种类和用量、洗脱剂种类和用量等一系列影响固相萃取的因素后,建立起一种石墨烯-管尖固相萃取结合液相色谱-串联质谱测定贝类样品中10种脂溶性贝类毒素的方法。将该方法应用于实际贝类样品的检测,实验结果令人满意。本文建立的方法操作简便、灵敏度高,拓展了石墨烯在复杂生物样品前处理领域的应用。