多孔芳香骨架吸附剂-固相萃取-高效液相色谱法同时测定辣椒粉中4种偶氮类染料

闻 威,张文芬,张岩皓,赵无垛*,张书胜

(1. 郑州大学化学与分子工程学院, 河南 郑州 450001;2. 香港浸会大学化学系环境与生物分析国家重点实验室, 香港 999077)

近年来,食品安全事件的频发使工业染料在食品中的非法添加和滥用引起了越来越广泛的重视。偶氮类染料在印染工业中的应用最为广泛,占了所有商业染料的50%以上[1]。由于其价格低廉、色泽鲜艳、着色稳定,常被不法商贩用作食品染料来代替常规的食用色素[2]。然而偶氮类化合物进入人体后会发生还原或分解,产生易致癌的芳香胺,引起机体病变和诱发癌症,危害人体健康,我国以及欧盟等国家已禁止在食品中使用该类染料[3,4]。

苏丹红染料是一类亲脂性苯基偶氮类衍生物,被广泛用作油、蜡、地板以及油墨中的染色剂[5,6],但其中的偶氮基和芳香环会对人体健康造成伤害,可能引发过敏和哮喘反应、DNA病变和肝癌等症状[7-10],国际癌症研究中心(IARC)已将其归为三级致癌物[11]。对位红具有与苏丹红相似的化学结构,对皮肤和呼吸系统均有刺激性,一些科学家认为它可能是一种遗传毒性的致癌物质[12,13]。酸性橙Ⅱ是一种典型的酸性水溶性偶氮染料,会对人体的神经系统、膀胱造成伤害,可能会引发癌症[14]。因此,建立简单、高效、快速测定食品中偶氮类染料的方法对保障食品安全及人类健康具有重要意义。

目前,用于不同食品中偶氮类染料的检测方法有高效液相色谱法[15]、液相色谱-串联质谱法[16,17]、气相色谱-质谱联用法[18]、毛细管电泳法[19]、酶联免疫测定法[20]等,其中高效液相色谱法因其操作简单、成本低、重现性好等优点被广泛应用。考虑到染料在食品中的痕量存在以及样品基质的复杂性,样品前处理在整个分析过程中也起着举足轻重的作用。偶氮类染料检测的前处理方法有固相萃取[21-23]、液液萃取[24,25]、固相微萃取[26]、分子印迹固相萃取[27]等,其中固相萃取技术作为一种成熟的前处理方法较为受欢迎,而固相萃取富集和净化效果与固相萃取吸附剂的选择息息相关。多孔芳香骨架(PAF)作为一种新型的多孔材料,具有均匀的孔径结构、较大的比表面积以及特殊的分子结构,常被用作固相萃取吸附材料[28,29]。

本文基于具有多重作用位点、自制的PAF-6固相萃取吸附剂,通过其与目标物之间产生氢键、π-π共轭等作用力实现了对复杂样品基质中对位红、酸性橙Ⅱ、苏丹红Ⅰ和苏丹红Ⅱ的同时提取富集,建立了一种固相萃取-高效液相色谱同时测定辣椒粉中4种偶氮类染料的方法,结果令人满意。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Agilent 1260高效液相色谱仪,内置G1314VWD紫外检测器(美国Agilent公司); Cintra2020紫外分光光度计(澳大利亚GBC公司); Sigma3-30台式高速离心机(美国Sigma公司);姚仪牌TTL-DC Ⅱ型氮吹仪(北京华仪通泰科技有限公司); METTLER TOLEDO Xp205电子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司);超纯水制备仪MilliQ Advantage (美国Millipore公司); MS3 basic涡旋混合器(美国IKA公司); KQ-3200E超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司); 20孔固相萃取装置(美国Waters公司)。

对位红(纯度>99.0%)、酸性橙Ⅱ(纯度>98.6%)、苏丹红Ⅰ(纯度>99.0%)和苏丹红Ⅱ(纯度>99.0%)标准品均购于美国Sigma-Aldrich公司;甲醇、乙腈均为色谱级试剂,购自美国Thermo Fisher公司;甲酸、氨水、二氯甲烷等其他试剂均为分析纯,购自郑州三鑫化学试剂有限公司;3 cc规格的聚丙烯固相萃取小柱及配套的20 μm孔径聚四氟乙烯(PTFE)筛板购自迪马科技有限公司;研究过程中所使用的纯水均经过Milli-Q纯水系统纯化;辣椒粉样品购自郑州各农贸市场。

PAF-6的合成方法参照本课题组之前的工作[30,31],由三聚氯氰和无水哌嗪在1,4-二氧六环(无水)溶液中回流反应得到。并用红外光谱、扫描电镜和固体核磁进行了表征,红外谱图1 300和1 491 cm-1处的吸收峰为哌嗪(-C-N-)和三聚氯氰(-C=N-)键的特征吸收峰;扫描电镜图中PAF-6纳米粒子为层状堆积,直径大小约为200 nm;固体核磁谱图中,在化学位移δ=44 ppm(10-6)处对应哌嗪环上sp3杂化的饱和碳原子的共振峰,在δ=166和169 ppm处对应三聚氯氰环上sp2杂化的不饱和碳原子的共振峰。上述数据与实验室前期工作一致,证明PAF-6被成功制备。

1.2 标准溶液的配制

标准储备液的配制:分别精确称取10.00 mg对位红、酸性橙Ⅱ、苏丹红Ⅰ和苏丹红Ⅱ标准品,用甲醇溶解并定容至100 mL,配制成质量浓度为100 mg/L的单标准储备液。置于4 ℃冰箱中密封避光保存。

4种物质混合标准溶液的配制:分别移取1 mL上述4种单标准储备液于10 mL容量瓶中,高纯水定容至刻度,即得10 mg/L的混合标准储备液,于4 ℃密封避光保存。

工作液的配制:将储备液用流动相比例的溶液逐级稀释至所需浓度。

1.3 样品前处理

称取2.0 g粉碎均匀的辣椒粉于50 mL离心管中,加入10 mL乙腈,超声提取20 min后以5 000 r/min的速度离心5 min,取上清液,重复提取两次,合并上清液。于40 ℃水浴下氮气吹干,用10 mL 5%(体积分数,下同)的甲醇水溶液溶解,于4 ℃储存待用[23]。

取10 mL上述样品溶液,经过自制30 mg/3 mL PAF-6固相萃取小柱,进行富集净化。PAF-6固相萃取小柱预处理过程:3 mL甲醇活化,3 mL水淋洗,上样,5 mL水淋洗,3 mL 10%氨化乙腈洗脱。洗脱液于40 ℃水浴条件下用氮气吹干,用1 mL流动相溶液复溶,经0.22 μm有机滤膜过滤,滤液供HPLC检测。固相萃取流程见图1。

图 1 固相萃取流程Fig. 1 SPE process scheme PAF-6: porous aromatic framework-6.

表 1 主客体分子间吸附能量ΔEn

Note: DFT/B3LYP/6-31+G basis set from the Gaussian 09 program was used for model optimization and energy calculation.

1.4 色谱条件

色谱柱:Unitary C18色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm);柱温:30 ℃;流动相:甲醇-0.2%甲酸水溶液(90∶10, v/v);紫外吸收波长:500 nm;流速:1.0 mL/min;进样量:20 μL。

1.5 量子化学计算方法

基于密度泛函数理论(density functional theory, DFT),采用Gaussian 09程序DFT/B3LYP/6-31+G基组对主客体分子结构模型进行优化和能量计算[32]。

2 结果与讨论

2.1 分子间作用机理考察

量子化学计算能够直接和量化地描述PAF-6与目标分子之间化学吸附的作用力大小及种类,本文借助Gaussian 09程序的DFT/B3LYP/6-31+G基组进行模型优化和能量计算。在DFT算法下对PAF-6与目标物分子进行结构模型优化计算,其优化结果见图2a～2e。模拟计算的吸附能如表1所示,计算公式如下:

ΔEn=EPAF-6-n-EPAF-6-En

(1)

其中ΔEn表示PAF-6与目标分子之间的吸附能,EPAF-6-n表示PAF-6与目标分子形成的超分子能量,EPAF-6表示PAF-6的能量,En表示目标分子能量。

从表1可知,主体分子PAF-6与目标分子之间的吸附能量都比较高,并且吸附是自发进行的,从而证明目标分子可以稳定地吸附在PAF-6分子中。由图2可知,大多数目标分子被吸附在孔径中,主要是主体分子PAF-6具有较大比表面积和孔径结构,因此客体小分子可以稳定地吸附在PAF-6分子孔腔中。从模拟计算结果可知,PAF-6是一种混合模式吸附材料,可以提供π-π作用、氢键作用等多重作用力。因此,可以对偶氮类染料具有较强的吸附。

图 2 (a)主体分子PAF-6及(b-e)主客体分子最优的构象Fig. 2 Most stable structures of (a) host PAF-6molecule and (b-e) host-guest molecule Using the DFT/B3LYP/6-31+G basis set from the Gaussian 09 program. Gray: carbon; white: hydrogen; red: oxygen; blue: nitrogen. Red circle: host-guest intermolecular interaction.

2.2 固相萃取条件的优化

本文对影响固相萃取效率的诸多因素进行了考察,包括吸附剂用量、洗脱剂种类、洗脱剂体积、样品溶液pH等,以期找出PAF-6吸附剂在样品基质中最大限度地对目标物进行富集净化的条件。考虑到样品基质的影响,固相萃取各个条件的优化均在样品基质中进行,即在0.5 mg/L的添加水平下平行测定3次。

2.2.1PAF-6吸附剂用量

吸附剂用量是影响固相萃取效率的重要因素。合适的用量在保证柱容量的同时还可以节约实验成本。所以本研究首先对PAF-6吸附剂的用量进行了探究,分别考察了吸附剂用量为10、20、30、40和60 mg时回收率的变化。结果见图3a,随着吸附剂用量的增加,4种物质的回收率均有升高,当用量超过30 mg后,各物质的回收率基本不再变化。因此最终选择30 mg填料量的固相萃取小柱进行后续研究。

2.2.2洗脱剂种类

不同有机溶剂对4种偶氮类化合物的洗脱能力不同,因此有必要对洗脱剂种类进行优化,以达到较高的回收率。本研究选用甲醇、乙醇、乙腈和二氯甲烷作为洗脱剂进行试验,但结果表明这4种有机溶剂对目标物的洗脱能力均较弱,回收率较低。后来向有机溶剂中加入少量氨水后进行试验,回收率大大提高。这可能是由于在碱性条件下,目标物以分子状态存在,PAF-6吸附剂与目标物之间的氢键作用力减弱,使目标物更容易洗脱下来。因此考察了5%氨化甲醇、5%氨化乙醇、5%氨化乙腈和5%氨化二氯甲烷对4种目标物的洗脱能力,结果见图3b, 5%氨化乙腈对4种染料均有较好的洗脱效果,因此选用5%氨化乙腈为最佳洗脱剂。此外,还对乙腈中氨水含量对回收率的影响进行了考察,结果见图3c。可以看出,当以10%氨化乙腈为洗脱剂时,4种物质的回收率达到最大,后来随着乙腈中氨水含量的增加回收率反而有所下降,可能由于在偏碱性条件下,目标物与洗脱溶剂的作用减弱导致,因此后续研究均采用10%氨化乙腈为洗脱剂。

图 3 (a)吸附剂用量、(b)不同种类体积分数为5%的氨化洗脱剂、(c)不同体积分数的氨化乙腈、(d)上样速率、(e)洗脱剂体积、(f)样品pH和(g)吸附剂重复使用次数对4种偶氮染料回收率的影响Fig. 3 Effects of different (a) amounts of sorbent, (b) types of 5% (volume percentage) ammoniation eluent, (c) volume percentages of ammoniated acetonitrile, (d) flow rates, (e) eluent volumes, (f) sample pHs and (g) sorbent reuse times on the recoveries of the four azo dyes

2.2.3上样速率

为了在相对较短的时间内获得较高的萃取效率,考察了上样速率对4种偶氮染料萃取效率的影响,结果见图3d。将样品溶液分别以1.0、2.0、3.0、5.0和6.0 mL/min的上样速率通过自制SPE小柱,在上样速率为3.0 mL/min时,4种目标分析物的回收率达到最大,继续增大上样速率,目标分析物与萃取填料的接触时间变短,萃取效率有所下降。因此,本研究以3.0 mL/min的速率上样。

2.2.4洗脱剂用量

洗脱剂用量影响目标物从吸附剂上洗脱下来的程度。洗脱剂用量太少会使目标物洗脱不完全,用量太多不但会造成溶剂上的浪费,也会增加后续的工作量,因此本文考察了不同体积(1、2、3、5和7 mL)的洗脱剂对4种偶氮染料的洗脱情况。结果见图3e,当洗脱剂体积达到3 mL时,4种目标物的回收率达到最大且后续没有明显的增加。综合考虑实验结果与实验成本,最终选择3 mL 10%氨化乙腈作为最佳洗脱剂用量。

2.2.5样品溶液pH

样品溶液pH决定了目标分析物在溶液中的存在状态,状态不同,其与PAF-6吸附剂之间的作用力也不同,从而影响到回收率的大小。因此对样品溶液pH的探究具有十分重要的意义。本文考察了样品溶液pH分别为2、4、6和8时回收率的变化情况。结果见图3f,样品溶液pH在4～6范围内,4种目标物的回收率可达到85%以上,但在强酸或弱碱条件下回收率均较低,可能是由于在强酸条件下,多孔材料PAF-6本身的性质发生了变化,而在弱碱条件下,目标物以分子形式存在,与PAF-6之间的氢键作用力较弱,不利于吸附。因此,本研究最终选择调节样品溶液pH为4。

2.2.6材料重复利用性

为了能够重复利用PAF-6吸附剂,减少实验成本,本文还对材料的重复利用率进行了探究。将用过的固相萃取小柱经甲醇、乙腈、高纯水净化后再次用于样品前处理过程。结果见图3g,自制SPE小柱使用4次后回收率虽有所下降,但仍高于80%,说明多孔材料PAF-6对4种偶氮类化合物的吸附性能良好,且可以重复利用。为了保证实验结果的精确性,最终选择重复使用小柱两次。

2.3 方法学考察

2.3.1检出限、定量限和线性范围

在上述最优条件下,以3倍信噪比(S/N=3)计算出4种偶氮染料的检出限为1.5～7.0 μg/L,以10倍信噪比(S/N=10)计算出4种偶氮染料的定量限为5.0～22.1 μg/L。将4种偶氮染料的标准储备液逐级稀释,以4种偶氮染料的质量浓度(x, μg/L)为横坐标、对应的峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线。目标物在10～300 μg/L范围内表现出良好的线性关系,相关系数(r)均大于0.999,结果见表2。

表 2 4种偶氮染料的回归方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

表 3 辣椒粉中4种偶氮类染料的加标回收率和相对标准偏差(n=6)

2.3.2准确度与精密度

通过向空白样品基质中加入低、中、高3个不同水平的4种目标物标准溶液进行加标回收试验,以空白样品基质加标的回收率表示方法的准确度,以同一天6份平行样品测定结果的相对标准偏差作为日内精密度,以连续6天样品测定结果的相对标准偏差作为日间精密度,以此来考察本方法的准确度与精密度,结果见表3。4种目标物的平均加标回收率为76.5%～89.8%,相对标准偏差(RSD)不大于5.3%(n=6),以上结果表明,本方法准确度与精密度良好,可以满足辣椒粉样品中对位红、酸性橙Ⅱ、苏丹红Ⅰ和苏丹红Ⅱ4种偶氮类染料的检测需求。

2.4 实际样品测定

采用本文所建立的SPE-HPLC方法对24份辣椒粉样品(样品编号为1～24)中4种偶氮类化合物的含量进行了分析测定。结果(见图4)显示,仅在一份样品(3号辣椒粉)中检测出了目标物对位红,含量为170.3 μg/kg。3号辣椒粉样品经固相萃取处理后的色谱图以及加标色谱图见图4。

2.5 方法对比

为了对本方法进行评价,将其与相关文献方法进行了比较,结果见表4。通过对方法的样品前处理技术、检测手段、检出限、精密度和回收率的比较显示,本方法操作简便,具有较低的检出限、较好的重复性和较高的准确度。

表 4 本方法与相关文献中方法的比较

DAD: diode array detector.

图 4 (a)加标样品和(b)空白样品经SPE处理后4种偶氮染料的色谱图Fig. 4 Chromatograms of the four azo dyes in the (a) blank and (b) spiked samples treated with SPE a. blank sample; b. sample spiked with 0.7 mg/L azo dyes. Conditions: column, Unitary C18 column (150 mm×4.6 mm, 5 μm); mobile phase, methyl alcohol-0.2% (volume percentage) formic acid in water (90∶10, v/v); flow rate, 1.0 mL/min; detection wavelength, 500 nm; injection volume, 20 μL; column temperature, 30 ℃. Peak Nos.: 1. Para Red, 2. Sudan Ⅰ, 3. Sudan Ⅱ, 4. Orange Ⅱ sodium salt.

3 结论

本文基于PAF-6固相萃取吸附剂,建立了同时检测辣椒粉中对位红、酸性橙Ⅱ、苏丹红Ⅰ和苏丹红Ⅱ4种偶氮类染料的SPE-HPLC方法。在最优固相萃取实验条件下,PAF-6吸附剂展现出了良好的富集净化效果,在保证回收率的前提下可有效降低杂质对液相色谱分离的影响。该方法简便、灵敏、准确,满足实际样品的检测要求。