啮齿动物热量限制的注意事项

张少红 陈国芳 刘超

[摘要] 热量限制在延缓衰老、抗癌、治疗糖尿病等慢性代谢疾病的作用显著，目前热量限制的方案并没有统一的标准，具有明显争议。限食的时间长短、组份、喂养的时间段不同，动物的种类等都可能影响实验的结果，本文就热量限制过程中的相关影响因素进行综述。

[关键词] 啮齿动物；热量限制；方案；影响因素

[中图分类号] R376 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2019）04（b）-0157-04

The matters need attention of calorie restriction in rodents

ZHANG Shaohong CHEN Guofang LIU Chao

Department of Endocrinology， Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Nanjing University of Chinese Medicine， Jiangsu Province， Nanjing 210028， China

[Abstract] Calorie restriction has a significant role in delaying aging， anti-cancer， and treating chronic metabolic diseases such as diabetes. Currently， there is no uniform standard scheme for calorie restriction programs， which is obviously controversial. The length of time， the composition of food， the feeding time and the type of animal may affect the results of the experiment. This paper reviews the relevant influence factors in the process of calorie restriction.

[Key words] Rodents； Calorie restriction； Scheme； Influence factors

热量限制（calorie restriction，CR）是一种能量摄入减少（一般将摄入量减少15%～40%），但保证具有足够营养的供应，亦称限食。适度的限食缓解了与2型糖尿病、心血管疾病和癌症等的发病有关的多种代谢问题[1]。限食的的形式各样，根据食物种类可分为低热量、低碳水化合物、低脂限食等；根据时间可分为短期限食（一般7～9 d），长期限食（>9 d）[2]；根据限制程度，可分为低热量限食和极低热量限食[3]；根据限食频率可分为连续性限食、间歇性限食。限食的方案目前并没有一个统一的标准，以上几种的限食方法在临床和动物研究中均有应用。限食的具体程度不一、形式多样，不断发展的限食模式虽日趋成熟，但仍有一些问题应该引起注意：①限食的时间需要多长才能有效？②基因型和性别对限食有什么影响？③限食过程喂养的计划有多重要？④饮食组份起什么作用？

1 限食多久是有效的？

大多数关于CR的研究都是先进行长期治疗（>9 d），观察其保护机体损伤、改善糖脂代谢，抵抗肥胖、糖尿病，延缓衰老等的机制。有学者[4]将CR的干预措施定义为从1 d到几个月不等。长期限食的效果毋庸置疑，如Park等[5]报道了30%CR持续4～6周，提高了葡萄糖耐量和胰岛素敏感性；16周CR后小鼠中认知表现更好[6]；在小鼠CR后4周发现脑中炎性反应改善[7]；在对高脂喂养联合链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠限食8周后发现其并发症明显减少[8]。但短期甚至几天的时间热量限制对疾病的治疗也是有益的。有研究表明限食可以减轻神经元损伤，还可增加对大鼠缺血性中风的保护作用[9-10]。Longo等[11]发现短期限食和禁食对小鼠体内化疗的具有有益作用。Perry[12]通过短期（3 d）低热量饮食（正常组摄入量的1/4）发现2型糖尿病大鼠糖代谢、肝脏的胰岛素抵抗明显改善。以往所认为的限食，多以长期为主，在短期的干预中也取得了明显的效果，若应用于肥胖等代谢疾病的治疗，虽具有重要意义，但不得不考虑在短期干预结束后，会不会带来更严重的体重反弹等问题。

2 基因型和性别对CR的影响

大多数关于CR对小鼠寿命和死亡率影响的数据都认为在热量限制和寿命增加存在接近线性的关系，近年来，这一公认的CR原则受到了质疑，特别是关于CR可对同一物种甚至菌株具有普遍延长寿命的的观点。在一项对1934～2012年进行的研究中使用数据的Meta分析表明CR在小鼠中的寿命延长效应为4%～27%，并且这些结果在重组近交系小鼠中比较不理想。Liao等[13]的实验对小鼠的ilsxiss重组自交系进行寿命分析，发现CR对生存的影响依赖于菌株和性别，为CR的反应在生存方面存在差异提供了有力的证据。有研究使用DBA/2J小鼠的不同性别和两种CR水平（20%和40%），并发现当维持在40%CR时，DBA雌性的最大寿命增加37.3%，雄性增加29.8%[14]。然而，40%的CR对B6雌性的存活率有不利影响。这些结果表明基因型、性别和CR等级之间有很强的相互作用。识别可以预测个体应变和性别的反应性或缺乏反应性的特定生物标志物，可以使我们对CR的潜在机制更好的了解。

3 喂养时间表的重要性

在过去的几十年里，人们一直在争论热量的实际减少是否对提高CR治疗肥胖、糖尿病和抗衰老等的能力是必要的，又或者限食的模式是否通過改变了喂食时间表，而不是直接的能量消耗产生有益的效果。一直以来研究较多的是每日限食，在喂养的时间点的问题上，主要是间歇性能量限制（intermittent energy restriction，IER）和限时喂养（time-restricted feeding，TRF）两种形式。

3.1 IER

一般来说，间歇性能量限制是指定期减少或消除能量的摄入，包括隔日限食（每隔1 d进行限食）、每周限食2～3 d（或将摄入能量控制在每周正常饮食水平的1/4以下）等形式。许多研究，实行IER方案，结果显示确实对机体代谢具有明显改善作用，可产生明显的有益影响。Wan等[15]是第一个证明在幼鼠（SD）中使用隔日限食喂养6个月可降低血压和心率。Tikoo等[16]使用隔日限食方案8周后观察到其具有保护肾脏和降低高血压的效果。Belkacemi等[17]研究表明，间歇限食可以通过保护胰腺细胞来改善1型糖尿病大鼠的胰岛素缺乏和葡萄糖耐受不良。尽管具体的机制尚未明确，可能是通过使细胞应激耐受性增强来对β细胞进行保护[18]。而有一些实验室已经开始探索间断限食的新方案，比如Brandhorst等[19]提出了“限食模拟饮食”（fastingmimicking diet，FMD），肥胖小鼠予以FMD饮食喂养，发现脂肪、体重明显减少，癌症发病率显著降低，生存率提高。在啮齿动物模型中间断限食，在改善肥胖小鼠的糖脂代谢、生存质量等方面具有重要作用。

3.2 限时喂养（TRF）

间断限食是以天数为间隔，限时喂养这种类型的饮食方案是指限制每天摄入热量在一定的时间内完喂食（如4～6 h内）。在肥胖的许多研究支持限食喂养对健康是有积极意义的。Duncan[20]发现HFD（60%脂肪）与低脂（10%脂肪）和HFD并且限饲8 h喂养时，限时喂养小鼠体重和肝脏重量减轻，葡萄糖耐量改善。Belkacemi等[21]研究HFD喂养的沙鼠产生胰岛素抵抗和糖尿病，但可以通过每天8 h的限时喂养来改善糖尿病。同样，其他研究[22-23]证明当对C57BL/6J小鼠HFD（61%脂肪）每天8 h的限时喂养，限时喂养组的热量摄入量与正常喂养组的却没有差别，但肝脂肪變性减少，肥胖、高胰岛素血症均得到改善。限时间段的饲养似乎是这些方案的获益的一个关键因素。Haraguchi等[24]在HFD的小鼠上检查了各种限时的时间方案。当在光照或黑暗期间将摄食限制在4 h，在热量摄入不受影响的情况下，体重和脂肪也会减少。TRF的饮食模式虽然在延缓衰老方面的还没有充分研究，但在高脂饮食诱导的肥胖相关代谢疾病中的有益作用是不容忽视的。

4 饮食构成的作用

动物中进行热量限制比想象中更复杂一些，如何贯彻实施CR饮食已经成为啮齿动物研究中的一个重要问题。大部分已发表的饮食组份研究都是在短期的啮齿动物模型中进行的，但结果并不一致。如Halade等[25]观察在饲喂含有鱼油的饲料的小鼠与玉米油相比寿命增加，但Tsuduki等[26]的研究结果是降低的，与之截然相反。CR研究的标准方法，是向对照动物随意提供食物，实验组予以定量的食物，如果没有补充必需的营养素，限食组就可能营养不良而影响实验结果。我们这里重点讨论宏观营养素，特别是蛋白质。涉及饮食中蛋白质特异性降低的研究发现，啮齿类动物的反应与CR喂养的动物相似[27]。然而，早期报告大部分都表明，操纵宏观和微观营养成分对生存没有重大影响。最近的一些研究已经在小鼠研究中提供了高度系统的蛋白质含量控制[28]。例如，40%的蛋白质限制饮食（protein restriction，PR）时，两组在保持非常相似的热量摄入的情况下，出现了CR对大鼠线粒体ROS产生和氧化损伤的影响。但当减少其他常量营养素时，并没有出现上述的影响，可能是因为蛋白质或氨基酸在热量摄入中的特殊作用所导致的[29-30]。Speakman等[31]对PR与CR的发展历史和争议进行了全面整体的分析，限食对啮齿动物寿命的作用是由于总热量减少，而不是蛋白质或任何其他宏观营养素所导致。在啮齿动物研究中关于蛋白质饮食限制也是极具争议性，但总体来说，总热量的减少对改善动物的代谢情况、延缓衰老有重要意义。

5 小结

当然，除上述问题之外，限食也要注意其他的负面影响，可能对骨骼，伤口愈合和某些免疫反应有不利影响。在限食的动物的不同品系、方案、喂养的时间段等的选择，都可能影响实验的结果。但有一点是明确的，在慢性代谢疾病中限食是一个需要长期坚持并且效果显著的治疗方式。

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（收稿日期：2018-09-29 本文編辑：苏 畅）