桃金娘根总多酚的超声提取及抗氧化活性研究

银慧慧 刘伟 赵武

[摘要] 目的 探讨桃金娘根总多酚的超声提取工艺条件及其抗氧化活性。 方法 采用单因素和正交实验，对桃金娘根总多酚的提取工艺进行优化；采用福林酚试剂法在紫外-可见分光光度计下对桃金娘根总多酚的吸光度进行测定，计算其提取得率。采用1，1-二苯-2-苦基肼自由基（DPPH·）清除率和总抗氧化活性能力对桃金娘根总多酚的抗氧化活性进行评价。 结果 最佳提取工艺条件为乙醇浓度60%，料液比1∶40（g/mL），提取温度60℃，提取时间50 min，在此条件下提取得率达78.03 mg/g；桃金娘根总多酚的总抗氧化活性和DPPH·清除率均高于抗坏血酸。 结论 超声提取适用于桃金娘根总多酚的提取；桃金娘根总多酚为一种天然的抗氧化活性剂和自由基清除剂。

[关键词] 桃金娘根；总多酚；超声提取；正交试验；抗氧化活性

[中图分类号] R284.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2019）04（a）-0033-04

Ultrasonic extraction and antioxidant activity of total polyphenols from Myrtle root

YIN Huihui1 LIU Wei1 ZHAO Wu1 YANG Wuning2 MENG Fei1 JIANG Yuanming1 QIN Zhenhua1 SUN Jianhua1

1.Guangxi Veterinary Research Institute Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530001， China； 2.Guangxi Veterinary Drug Control Institute， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530001， China

[Abstract] Objective To study the ultrasonic extraction technology and antioxidant activity of total polyphenols from the root of Myrtle. Methods The extraction process of total polyphenols from the root of Myrtle was optimized by single factor and orthogonal experiment， and the absorbance of total polyphenols from the root of Myrtle was determined by Foline reagent under ultraviolet-visible spectrophotometer， and the extraction yield was calculated. The antioxidant activity was evaluated by 1，1-Diphyeny1-2-picrylhydrazyl free radical （DPPH·） scavenging rate and total antioxidant activity test. Results The optimum extraction conditions were ethanol concentration 60%， solid-liquid ratio 1∶40 （g/mL）， extraction temperature 60℃， extraction time 50 min. Under these conditions， the extraction yield was 78.03 mg/g. The total antioxidant activity and DPPH· scavenging rate of total polyphenols in the root of Myrtle were higher than that of ascorbic acid. Conclusion Ultrasound extraction is suitable for the extraction of total polyphenols from the root of Myrtle， which is a natural antioxidant and free radical scavenger.

[Key words] Root of Myrtle； Total polyphenols； Ultrasound extraction； Orthogonal test； Antioxidant activity

桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa）屬于热带性气候指示性植物，是一种优良的野生药用植物资源[1-2]，具有较高的医药及保健价值，广泛分布在中国和日本的南部等地区[3]。桃金娘根是桃金娘的干燥根，富含黄酮类、三萜类、多糖类以及多酚类等多种活性成分，收载于《兽药国家标准（化学药品、中药卷）第一册》中[4]。已知多酚类化合物具有抗氧化性和抗肿瘤等作用[5]。因此，从桃金娘中提取总多酚化合物具有良好的学术研究价值和规模开发利用前景。目前，桃金娘的研究主要是集中在其果实的研究应用[6-8]，而对桃金娘根多酚类化合物提取研究的报道较少。超声提取具有提取效率高、操作简便、低耗、提取周期短、提取条件稳定等优点，在植物活性成分开发和利用中已得到了广泛应用[9]。

本研究对桃金娘根总多酚的超声提取工艺条件进行了分析和优化，并采用1，1-二苯-2-苦基肼自由基（DPPH·）清除率和总抗氧化活性能力评价桃金娘根总多酚的抗氧化活性，旨在为桃金娘根中有效成分的提取以及桃金娘根的药用价值和保健作用的深入开发提供新的实验参考依据。

1 仪器与试药

1.1 主要仪器

UV2550紫外-可见分光光度计（日本岛津）、Milli-Q超纯水仪（Millipore公司）、F160型粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司）、SQP型（精度0.01 mg）电子天平（德国Sartorious公司）、CAP225D型电子天平（精度0.1 mg，德国Sartorious公司）、SK7200HP型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）。

1.2 主要试药

没食子酸对照品（中国食品药品检定研究院，纯度：89.9%，批号：110831-201605）、1，1-二苯-2-苦基肼自由基（AR，sigma公司，批号：EKKS1297）、Foline-Ciocalteu试剂0.5 mol/L（上海荔达生物科技有限公司）、试验所用试剂均为分析纯，水均为超纯水。

桃金娘根购自广西太华医药有限公司（产地：南宁），经广西植物所温放副研究员鉴定为Radix Rhodomyrti。

2 方法与结果

2.1 桃金娘根总多酚的提取

取适量桃金娘根，粉碎，过五号筛，精密称取适量细粉，置100 mL具塞锥形瓶内，按一定的料液比加入适量的乙醇溶液，按不同的因素水平进行超声提取（350 W，53 kHz），放冷，过滤，得到的粗提液置于4℃冰箱中备用。

2.2 桃金娘根总多酚测定方法

采用福林酚试剂，并通过紫外-分光光度法[10]进行测定。

2.2.1 对照品溶液配制 精密称取没食子酸对照品12.04 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，水溶解并定容至刻度，得到浓度为108.2 μg/mL的标准溶液。

2.2.2 标准曲线的绘制 分别精密吸取0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mL上述标准溶液置25 mL棕色容量瓶中，加入5 mL水，随后加入1.0 mL福林酚试剂，充分摇匀，静置1 min后，加入2.5 mL浓度为20%的Na2CO3溶液，水定容至刻度，于25℃下避光反应90 min后在分光光度计下于748 nm波长处测定其吸光度。以吸光度值为纵坐标，没食子酸浓度为横坐标绘制标准曲线。通过线性回归分析后得到的线性方程为：Y= 0.1025X + 0.08（R2 = 0.9949）。

2.2.3 样品总多酚的测定 精密吸取待测供试液1.0 mL置50 mL棕色容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。再精密量取稀释后的供试液1.0 mL于25 mL棕色容量瓶中，其余按“2.2.2”方法测定其吸光度。根据标准回归方程，计算提取得率[11]。

多酚提取得率（mg/g）=供试品多酚质量（mg）/桃金娘根原料质量（g）

2.3 桃金娘根总多酚提取的单因素试验设计

桃金娘根总多酚提取的单因素试验参考文献[12]。

2.3.1 提取溶剂浓度对桃金娘根总多酚提取得率的影响 精密称取1 g桃金娘根细粉，置100 mL 具塞锥形瓶内，固定料液比1∶10（g/mL），分别加入不同浓度乙醇溶液，超声（350 W，53 kHz，30℃）提取30 min，过滤，取相应浓度乙醇溶液定容于100 mL棕色容量瓶中，充分摇匀，其余按“2.2.2”方法测定其吸光度并计算总多酚含量。结果显示，随着乙醇浓度的增加，多酚类化合物受到高浓度乙醇中亲脂性强的成分影响[13]，使得提取率下降，当乙醇浓度为60%时具有最大提取得率。

2.3.2 料液比对桃金娘根总多酚提取得率的影响 精密称取1 g桃金娘根细粉，置100 mL具塞锥形瓶内，固定提取溶剂乙醇浓度60%，改变料液比，其余步骤及测定方法同“2.2.1”。结果显示，受料液比的影响[14]，当料液比超过1∶30（g/mL）时，桃金娘根总多酚的提取得率的增加变化较小。因此，选择料液比1∶30（g/mL）进行下一步实验。

2.3.3 提取温度对桃金娘根总多酚提取得率的影响 精密称取1 g桃金娘根细粉，置于100 mL 具塞锥形瓶内，固定提取溶剂乙醇浓度60%，料液比为1∶30（g/mL），改变提取温度，其余步骤及测定方法同“2.3.1”。在温度较高情况下，多酚类化合物稳定性降低[15]，当提取温度为50℃时，总多酚的提取得率最高。

2.3.4 提取时间对桃金娘根总多酚提取得率的影响 精密称取1 g桃金娘根细粉，置100 mL具塞锥形瓶内，固定提取溶剂乙醇浓度60%，料液比1∶30（g/mL），提取温度50℃，改变提取时间，其余步骤同“2.2.1”。当提取时间超过50 min后，多酚类化合物可能发生氧化或聚合等反应[16]，或由于热效应等影响[17]，使得提取得率下降。因此，选择50 min为最佳提取时间。

2.4 桃金娘根总多酚提取的正交试验[18]

参考文献[18]，采用正交试验优化桃金娘根总多酚的提取。

2.4.1 正交试验因素与水平 根据单因素实验的結果，选择合适的乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取温度（C）以及提取时间（D）进行四因素三水平的正交试验。见表1。

2.4.2 正交试验方案与结果 各因素对桃金娘根总多酚提取得率的影响大小次序为：A>B>C>D，A2B3C3D2为极差分析得到的最优提取条件组合，即乙醇浓度60%，料液比1∶40（g/mL），提取温度60℃，提取时间50 min。由于最佳提取工艺条件组合不在正交试验组合中，因此在最佳工艺条件下进行3次提取平行试验，桃金娘根粗多酚提取物得率为78.03 mg/g，说明该工艺稳定可行。正交试验设计及结果见表2。

2.5 桃金娘根总多酚抗氧化活性实验

2.5.1 总抗氧化活性的测定 测定方法参照文献[19]。分别精密吸取0.2 mL不同浓度的桃金娘根总多酚提取液，并依次加入2.5 mL磷酸盐缓冲液（pH 6.6，0.2 mol/L）和2.5 mL 1%铁氰化钾溶液（m/v），摇匀，于50℃水浴振荡20 min，冰浴冷却后加入2.5 mL 10%三氯乙酸（m/v），充分摇匀后精密吸取混液2.5 mL，再加入2.5 mL的水和0.1%氯化铁溶液（m/v），混合均匀，静置10 min，在700 nm波长处测定吸光度，记为A，以水代替提取液按照上述步骤作为空白并测定其吸光度，记为A0。总抗氧化活性可以用ΔA来表示，（ΔA=A-A0），ΔA越大，说明其总抗氧化活性越强。抗坏血酸溶液的总抗氧化活性测定步骤同上。随着总多酚和抗坏血酸浓度的增加吸光值也逐渐增大，总抗氧化活性能力逐渐增强。见图1。

2.5.2 DPPH·清除率的测定 测定方法参照文献[20]。依次精密吸取2×10-4 mol/L DPPH·溶液2 mL和不同浓度的提取液2 mL置于25 mL的比色管中，摇匀避光反应30 min，在517 nm波长下测定吸光度A，以2 mL无水乙醇代替提取液按照上述步骤反应作为空白，其吸光度为A0。清除率按下式进行计算：DPPH·的清除率（%）=（1-A/A0）×100%。抗坏血酸溶液的DPPH·清除率测定步骤同上。桃金娘根总多酚对DPPH·的清除能力随总多酚浓度增高而增大。见图2。

3 讨论

本研究通过单因素实验以及正交实验，探索桃金娘根总多酚超声提取的最佳工藝：乙醇浓度60%，料液比1∶40（g/mL），提取温度60℃，提取时间50 min，桃金娘根粗多酚的提取得率达78.03 mg/g。该方法具有操作简便、低耗、提取率高、污染小、提取条件稳定以及重现性好等优点，适用于桃金娘根总多酚的提取。此外，在本研究实验的浓度范围内，相同浓度下，桃金娘根总多酚的总抗氧化活性能力以及对DPPH·的清除能力优于抗坏血酸溶液。

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（收稿日期：2018-06-20 本文编辑：王 蕾）