凉州区奶牛乳房炎主要病原分离鉴定及药敏试验

尤从彪，刘添泰，王 斐

（1.凉州区畜牧兽医局，甘肃 武威 733000；2.甘肃新天马制药股份有限公司，武威 733000；3.甘肃省农业科学院畜草与绿色农业研究所，兰州 730070）

乳房炎是奶牛最常见的疾病之一，通常由侵入乳腺及乳导管内的病原菌引起，偶见化学性、机械性及乳房热损伤病例。根据病理表现可分为浆液性乳房炎、纤维素性乳房炎、化脓性乳房炎、出血性乳房炎、坏疽性乳房炎，根据临床观点可分为临床型和亚临床性（隐性）。乳房炎是导致泌乳牛产奶量下降最主要的原因之一，通常会引起乳汁质量降低［1］、泌乳减少或停止，甚至会导致慢性感染奶牛的淘汰和死亡［2-4］，给奶牛养殖业造成严重的经济损失。因此，及时了解本地养殖场乳房炎的感染情况，掌握主要病原菌的耐药情况，是畜牧兽医监管部门的必要工作，也是为当地奶牛产业保驾护航的重要措施。

目前国内关于奶牛乳房炎主要病原菌分离鉴定及药敏试验的研究非常普遍，相关研究结果对乳房炎的预防、诊断及治疗有着十分重要的作用。但引起奶牛乳房炎病原菌的种类和分布情况往往与地区环境有关，同时，该地区此前的用药史也是影响病原菌耐药性的重要因素。如果不能根据病原菌的实际耐药性进行治疗，不但可能贻误病情、无法及时控制乳房炎，更有可能引发更为严重的病原菌耐药性和兽药残留的问题［5］，严重威胁公共卫生及奶制品食品安全。目前，尚未有甘肃省武威市凉州区奶牛养殖场乳房炎发病情况的调查和研究。因此，本研究对该地区的1 000头中国荷斯坦奶牛进行了乳房炎调查、细菌学鉴定及药敏试验，为今后凉州区奶牛乳房炎的预防、诊断和治疗及流行病学调查和主要病原菌耐药性的研究提供可靠的数据。

1 材料与方法

1.1 动物来源

甘肃省武威市凉州区5个奶牛养殖场共计1 000头奶牛，年龄2～6岁，均为经产母牛。

1.2 材料

兰州奶牛隐性乳房炎诊断液（LMT）由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所提供。药敏纸片为英国Oxoid公司产品。

培养基：0.5%绵羊全血琼脂平板、伊红美兰琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、普通营养琼脂培养基为北京陆桥生物有限公司产品；水解酪蛋白琼脂（MH）购自杭州微生物试剂有限公司。

1.3 方法

1.3.1 奶样采集及LMT检测 采集前，对奶牛乳房、乳头及挤奶人员的手部清洗后，用酒精棉消毒。采集时，弃去前三把奶，取不同乳区奶样，分别加入LMT检验皿的4个小盘内，并倾斜检验皿倒出多余乳样，每个小盘约剩余奶样2 mL；每个小盘内再加入LMT检验液2 mL，平稳摇动检验皿充分混匀，约10 s后观察混合物性状（表1）。采集检出结果为阳性的奶样，置于经高压灭菌的10 mL离心管中，标明所采样品的编号、日期等，冷藏并尽快运送至实验室。

表1奶牛亚临床性CMT标准

1.3.2 临床型乳房炎诊断 奶牛乳房肿胀、热、发红；触诊时存在明显肿块，奶牛表现出明显疼痛，对犊牛或挤奶人员有抵触现象；挤奶时可见牛奶性状发生眼观变化，质地稀薄，存在片状或块状凝固物，混有炎性脓液，偶见鲜血（表2）。严重者可伴随全身病理性变化，包括体温升高、精神沉郁、食欲不振、反刍频率降低等。

表2正常牛奶与临床型乳房炎牛奶的对比

1.3.3 细菌分离纯化 将采集的样品摇匀，挑取少许接种于营养肉汤中增菌培养，37℃培养24 h。取生长良好的样品划线接种于绵羊全血琼脂平板，37℃培养24 h，观察记录菌落生长形态及溶血状况。挑取生长特性及形态不同的单个菌落，接种于营养肉汤中培养，37℃恒温培养24 h。细菌菌液，分别进行涂片、革兰氏染色、镜检，挑取镜检涂片无杂菌者，涂划血斜面，37℃培养24 h后低温保存。

1.3.4 细菌生化特性鉴定 根据染色镜检初步鉴定结果，对分离到的菌株进行如下生化试验。

在麦康凯琼脂平板上菌落为粉红色、在伊红美蓝琼脂上产生黑色带金属闪光的菌株进行如下生化试验：V-P实验、枸橼酸盐、甲基红和吲哚实验、三糖铁斜面培养。三糖铁发酵产酸产气，且符合吲哚（+/-）、甲基红（+）、V（-）、枸橼酸盐发酵试验（-）的菌种即可鉴定为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）。

在肉汤中生长浑浊一致、镜检结果为葡萄球菌属的菌株进行如下生化试验：触酶试验、兔血浆凝固酶试验、甘露醇发酵试验。触酶试验阳性、凝固酶试验阳性且在需氧和厌氧环境下甘露醇都能发酵的菌种即可鉴定为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。

在血琼脂平板上菌落较小、溶血，且镜检成不同程度链状的菌株（链球菌属，Streptococcus spp.）进行如下生化试验：CAMP试验、七叶苷水解试验、马尿酸钠水解试验和6.5%NaCl肉汤生长试验。根据试验结果区分无乳链球菌（Str.agalactiae）、停乳链球菌（Str.dysgalactiae）、乳房链球菌（Str.uberis）和粪链球菌（又名粪肠球菌，Enterococcus faecalis）（表 3）。

表3病原链球菌生化特性

1.3.5 药物敏感性检测（纸片扩散法） 对分离出的主要病原菌按不同属分别进行药物敏感性检测。采用纸片扩散法（Kirby-Bauer法）［6］：将分离纯化的细菌接种于营养肉汤中，37℃培养18～24 h；用生理盐水稀释至与标准比浊管浊度相当；接种于MH琼脂平板上，每个平板上放置5个药敏纸片；每个菌种设置3个重复；37℃培养18～20 h后测定细菌抑菌环的直径。根据美国临床实验室标准化协会（CLSI）推荐的标准，判定病原菌对药物的敏感性（表3）。

药敏纸片：青霉素（penicillin，Pen），氨苄西林（ampicillin，Amp），头孢唑林（cefazolin，Caf），庆大霉素（gentamicin，Gen），链霉素（streptomycin，Str），诺氟沙星（norfloxacin，Nof），氧氟沙星（ofloxacin，Ofl），复方新诺明（SMZ-TMP），氯霉素（chloramphenicol，Chl），红霉素（erythrocin，Ery），四环素（tetracycline，Tet），卡那霉素（kanamycin，Kan）。

表4 CLSI药敏纸片法结果判断标准mm

2 结果与分析

2.1 奶牛乳房炎发病情况

共检测武威市凉州区1 000头奶牛3 991份奶样，其中CMT阳性奶样1 456份，来自365头奶牛，奶牛亚临床性乳房炎发病率36.50%；临床型乳房炎奶样728份，来自182头奶牛，奶牛临床型乳房炎发病率18.20%；总感染率54.70%，阳性乳区率54.72%（表5）。

表5凉州区部分养殖场奶牛乳房炎发病率

2.2 主要病原菌分离鉴定

分别取临床型乳房炎和亚临床型乳房炎奶样各400份，分离纯化病原菌。其中655份奶样中只分离出一种病原菌，69份奶样中分离出两种病原菌；分离出3种及3种以上病原菌的奶样弃之。

不同类型乳房炎奶样中分离出的主要病原菌均为金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌及链球菌属细菌，但各自占比不同。在临床型乳房炎奶样中共分离得到412株病原菌，以链球菌属最多，共224株（54.37%），金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌分别为121株（29.37%）和49株（11.89%）；而亚临床型乳房炎奶样中共分离得到381株病原菌，其中金黄色葡萄球菌最多，共185株（48.56%），链球菌属次之，共84株（22.05%），大肠埃希氏菌依然最少，共71株（18.64%）（表6）。

表6凉州区部分养殖场奶牛乳房炎主要病原菌

通过生化试验共分离鉴定出无乳链球菌161株、停乳链球菌80株、乳房链球菌132株、粪链球菌27株、其他链球菌9株。同样，在不同类型乳房炎奶样中链球菌的分布也不相同（表7）。

2.3 药敏试验

共对308株链球菌、306株金黄色葡萄球菌和120株大肠埃希氏菌分别进行了药敏试验。因分离所得链球菌均为β溶血型，故合并进行药敏试验。结果显示：链球菌对青霉素、氨苄西林、红霉素和四环素耐药性较强，对氧氟沙星和氯霉素较敏感；金黄色葡萄球菌对青霉素、四环素、红霉素耐药性较强，对复方新诺明耐药性较弱，对诺氟沙星、氧氟沙星、庆大霉素较敏感；大肠埃希氏菌对四环素、链霉素、氨苄西林、头孢唑林、复方新诺明有一定的耐药性，对庆大霉素、诺氟沙星、氧氟沙星、氯霉素敏感（表8）。其中，部分菌种表现多重耐药性（表9）。

表7不同乳房炎中的链球菌分布情况

表8凉州区部分养殖场奶牛乳房炎主要病原菌药敏试验

表9分离病原菌的多重耐药性

3 讨论

奶牛乳房炎是由物理、化学或微生物等因素刺激奶牛乳腺所引发的一种炎症反应，多种病原微生物的感染是引起奶牛乳房炎的主要病因，其中主要的病原菌是大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌等［7-9］。该病广泛存在于世界各地，发生率一直相当高［10-12］。它不仅仅给世界奶牛养殖业带来了巨大的经济损失，也给乳品工业的发展、公共卫生以及食品安全带来一定隐患。本次对凉州区1 000头泌乳奶牛乳房炎的流行病学进行了调查，结果表明，临床型乳房炎发病率18.20%，亚临床型乳房炎发病率36.50%，奶牛阳性率54.70%，乳区阳性率54.72%，与其他地区乳房炎的流行趋势基本一致［13-15］。但主要病原菌的流行情况略有差异，其他部分地区以链球菌属为主［16］，也有些地区以金黄色葡萄球菌为主［17-18］。本研究中，共分离出793株病原菌，其中临床型乳房炎奶样中以链球菌属最多（54.37%），而亚临床型中则以金黄色葡萄球菌为主（48.56%）。病原性乳房炎的发生主要与饲养及挤奶过程中的消毒和清洁工作有关，挤奶人员、设施及奶牛乳房消毒不彻底会导致交叉感染和二次感染。尤其是金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌，都属于环境性病原体，在饲养环境卫生状况良好的情况下，一般不会导致疾病的发生。因此，日常的饲养管理中，搞好环境卫生、注意清洁消毒对于预防和减少奶牛乳房炎的发生有着重要意义。

在耐药性试验中，链球菌和金黄色葡萄球菌都对青霉素极耐药，耐药率分别达到了61.04%和64.38%；此外，这两类病原菌还对红霉素、四环素、复方新诺明表现出了一定的耐药性，尤其是金黄色葡萄球菌，对四环素的耐药率高达40.52%。不过，链球菌对氧氟沙星的耐药率极低，仅为0.97%；金黄色葡萄球菌对诺氟沙星、氧氟沙星复方新诺明耐药性较低（＜10%），对庆大霉素、氯霉素、卡那霉素敏感。大肠埃希氏菌则对氨苄西林、头孢唑林、链霉素、四环素、复方新诺明的耐药性较强，对庆大霉素、诺氟沙星、氧氟沙星、氯霉素、卡那霉素敏感。因此，综合3种主要病原菌的耐药谱，建议凉州区奶牛养殖场在防治乳房炎时应避免使用β-内酰胺类、红霉素类、四环素类药物，以免发生“药量大、疗效微”的抗生素滥用，也避免进一步增强该地区乳房炎主要病原菌的耐药性，同时减少不合理使用抗生素带来的奶制品内抗生素残留问题。推荐喹诺酮类、庆大霉素类药物为适用药物，及时有效地对奶牛乳房炎进行治疗，切实保障凉州区养殖业生产安全、动物性食品安全、公共卫生安全和生态环境安全。