鲁中肉羊HIRA基因多态性及其与产羔数的关联分析

张仁森，刘秋月，潘林香，王金文，王翔宇，胡文萍，马 琳，狄 冉，储明星

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193；2.莱芜市嬴泰有机农业科技发展有限公司，山东 莱芜271114；3.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，济南 250100）

家畜的产（羔）仔数是一种重要的经济性状，提高产（羔）仔数对于提高畜牧业产值具有重要意义［1］。绵羊产羔数是一种数量性状，受多基因调控，而其遗传力仅为0.1左右［2］，因此通过常规育种技术提高绵羊产羔数耗时极长，效率低下。标记辅助选择可以通过影响选择的时间、强度以及准确性来极大地提高这类低遗传力性状的选择效率［3］。因此，寻找影响绵羊产羔数的分子遗传标记是实现绵羊产羔数标记辅助选择的先决条件。

全基因组重测序是目前挖掘功能基因的一种重要方式［4-8］。本实验室前期对10个绵羊品种的99个个体进行全基因组重测序，定义Z（Fst）＞5为显著位点，筛选获得可能与绵羊产羔数相关的候选基因HIRA（Histone cell cycle regulator）及其突变位点（g.71874104 G＞A及g.71833755 T＞C，其中g.71874104 G＞A位点位于启动子上游区域，g.71833755 T＞C位点位于内含子区域，该位点突变导致在该位置的氨基酸从亲水性谷氨酰胺变为碱性精氨酸），其Z（Fst）值为7.1，提示该基因可能与绵羊产羔数相关。HIRA是一种组蛋白调节基因，它位于绵羊17号染色体上，由27个外显子和26个内含子组成，编码1 091个氨基酸，其产物HIR/HIRA是组蛋白伴侣蛋白，其主要功能是辅助组蛋白完成核小体的解聚和重新装配，从而参与转录调节、基因沉默、细胞衰老等多种生物学过程［9］。HIRA的基因产物包含着一组保守的蛋白家族，在多种生物体如酵母、果蝇、小鼠、人类以及植物等中都有发现［10-11］，其对维持基因组的完整性以及细胞稳态具有重要作用［12］。HIRA基因首先在酵母中发现［13］，随后对HIRA基因的研究越来越多。研究发现，HIRA与异染色质区域的沉默和假转录本的抑制等有关，其缺失或突变会导致胚胎发育障碍、雌性不育等多种生理缺陷［14-19］。目前未见HIRA基因与鲁中肉羊产羔数之间关系的研究报道。

鲁中肉羊原产山东莱芜，是利用肉用性能好的白头杜泊羊与繁殖率高的湖羊杂交育种而成，具有增重快、料肉比高、抗粗饲、抗病、适合圈养等特点［20］。本研究以鲁中肉羊为对象，利用实验室前期重测序结果结合Sequenom MassARRAY®SNP技术对其HIRA基因g.71874104 G＞A和g.71833755 T＞C位点进行分型，探讨鲁中肉羊HIRA基因SNP位点的多态性，并分析其与鲁中肉羊产羔数的关联性，为鲁中肉羊产羔数的分子标记辅助育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 血样采集及数据测定

试验所用384只鲁中肉羊血样采自山东省莱芜市嬴泰有机农业科技发展有限公司。羊只营养以及管理水平均保持一致，年龄相近。采取颈静脉采血，柠檬酸葡萄糖抗凝，-20℃保存。同时记录其产羔季节、胎次与产羔数。

1.2 DNA提取

鲁中肉羊血液样本DNA使用TIANGEN（天根）血液DNA试剂盒提取，使用Nano Drop2000检测DNA样本浓度，DNA质量使用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.3 基因分型

对HIRA基因2个多态位点在鲁中肉羊中进行基因分型，采用Sequenom MassARRAY®SNP技术进行基因型检测［21］。分型样品为DNA，每个样品需要量为20 μL，DNA 浓度为 40～80 ng/μL。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2016软件统计鲁中肉羊HIRA基因2个多态位点基因型频率、等位基因频率、多态信息含量、杂合度和有效等位基因数，并进行Hardy-Weinberg平衡检验。产羔数关联分析如本实验室田志龙等［22］之前所述，采用SPSS19.0软件程序中一般线性模型完成鲁中肉羊基因型与产羔表型数据关联分析，所有数据以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 HIRA基因多态性分析

根据基因分型结果，发现鲁中肉羊HIRA基因g.71833755 T>C位点存在TT、TC和CC三种基因型

图1 HIRA基因g.71833755 T＞C位点分型结果

对上述2个位点在鲁中肉羊中的基因型频率和等位基因频率分别进行了统计，并计算上述2个位点在群体中的多态信息含量、杂合度和有效等位基因数，并用卡方检验检测2个位点在群体中的平衡状态，结果见表1。

图2 HIRA基因g.71874104 G＞A位点分型结果

从表1可知，鲁中肉羊HIRA基因g.71833755 T>C（图1），g.71874104 G>A位点存在AA、AG和GG三种基因型（图 2）。位点在鲁中肉羊中表现为低度多态（PIC<0.25），g.71874104 G>A位点在鲁中肉羊中表现为中度多态（0.25C位点在鲁中肉羊中处于哈代温伯格不平衡状态（P<0.05），g.71874104 G>A位点在鲁中肉羊中处于哈代温伯格平衡状态（P>0.05）。

表1 HIRA基因2个多态位点的群体遗传学分析

2.2 HIRA基因g.71833755T>C位点和g.71874104 G>A位点与鲁中肉羊产羔数的关系

从表2可以初步得出，HIRA基因g.71874104 G>A位点多态性与鲁中肉羊第2胎、第3胎产羔数显著关联（P<0.05），杂合型AG个体各胎产羔数均高于野生型GG和突变纯合型AA个体，其中AG型个体第2胎产羔数显著高于AA型个体（P<0.05），第3胎产羔数显著高于GG型个体；g.71833755 T>C位点多态性与鲁中肉羊第2胎产羔数显著关联（P<0.05），杂合型TC个体第2胎产羔数均高于野生型TT（P>0.05）和突变纯合型CC个体（P<0.05）。

表2 HIRA基因不同位点各基因型鲁中肉羊产羔数最小二乘均值及标准误 只

3 讨论

3.1 HIRA基因多态性分析及其与动物胚胎成活率之间的关系

HIRA基因g.71833755 T>C与g.71874104 G>A位点在NCBI中已有报道，但这两个位点与鲁中肉羊产羔数关联分析方面未有文献报道。群体多态信息含量分析发现，g.71874104 G＞A位点在鲁中肉羊中处于中度多态（0.25＜PIC＜0.5），表明该位点在鲁中肉羊中存在较强的选择潜力；而g.71833755 T＞C位点在鲁中肉羊中表现为低度多态（PIC＜0.25），表明该位点在鲁中肉羊中选择潜力较小。可见，不同位点在同一绵羊品种中受到的选择强度不同。卡方适合性检验结果表明，g.71874104 G＞A位点在鲁中肉羊中处于哈代温伯格平衡状态（P＞0.05），表明经过长期进化和选择，该位点在适应性方面具有一定的遗传优势；而g.71833755 T＞C位点在鲁中肉羊中处于哈代温伯格不平衡状态（P＜0.05），这可能是因为该位点受地域差异或者人工选择的影响较大，也可能是因为所使用的样本数偏少造成的。

排卵数和胚胎成活率是影响产羔数的重要指标［23］。在实际生产实践中发现胚胎数目多并不一定意味着实际的产羔数一定多。周梅等［24］研究发现，部分小尾寒羊母羊能够产生4～5个胚胎，然而最终的产羔数却只有2～3 个。Dilg 等［25］和 Pchelintsev 等［26］研究表明，HIRA基因的突变是导致胚胎死亡的重要因素。王玉凤等［27］研究发现，果蝇中过表达的dHira将会影响与细胞周期有关的基因表达，使早期胚胎的细胞核分裂不能同步，进而导致果蝇早期胚胎的大量死亡。王孟雨等［28］研究了HIRA敲除对银鲫胚胎发育的影响，结果发现HIRA的敲除会导致银鲫体节发育异常、循环系统障碍、围心腔水肿等胚胎发育异常现象，且伴随着出苗后鱼苗的大量死亡现象。Roberts等［18］研究发现，HIRA的突变会影响小鼠中内胚层的发育和分化，导致脊索、神经管及心脏回路发育缺陷，甚至导致胚胎在孕中期死亡。Nashun等［29］研究发现，HIRA的缺失会导致小鼠原始卵泡细胞的严重发育缺陷以及大量的卵母细胞死亡。Clift等［30］研究发现，HIRA的缺失会影响小鼠基因组中的核小体装配过程，导致无法形成雄性原核。Lin等［31］研究发现，HIRA突变的雌性小鼠能够正常排卵，但其在与野生型雄性交配后无法产生后代。然而在本研究中，HIRA基因 g.71874104 G＞A位点和g.71833755 T＞C位点突变均不会导致母羊不育，且二者的突变杂合子在鲁中肉羊中产羔数均最高，表明这两个位点突变杂合子母羊产生的卵子能够参与正常的受精过程，且形成的合子可能具有最强的胚胎发育能力，这与前人在其他物种中的研究结果并不一致。推测这可能与物种之间的差异有关，具体原因需要进一步的实验证明。

3.2 HIRA基因多态性与鲁中肉羊产羔数之间的关系

关联分析表明，g.71874104 G＞A和g.71833755 T＞C位点的突变对鲁中肉羊产羔数影响较大，这与Zhou等［32］在小尾寒羊中的研究结果相一致。在Ensemble数据库中查找发现g.71874104 G＞A位点位于HIRA基因转录起始位点上游255 bp处，因此，很有可能该突变位点位于HIRA基因的启动子区域，推测该位点的突变可能通过影响HIRA基因转录从而最终影响鲁中肉羊的产羔数，这需要进一步的实验证明。研究表明，动物的表型性状可因为基因某些位点的突变而显著改变［33-35］。g.71833755 T＞C位点突变导致在该位置的氨基酸从亲水性谷氨酰胺变为碱性精氨酸，但是该突变是如何影响鲁中肉羊产羔数性状的有待进一步研究。

4 结论

HIRA基因g.71874104 G＞A位点多态性与鲁中肉羊第2胎、第3胎产羔数显著关联；g.71833755 T＞C位点多态性与鲁中肉羊第2胎产羔数显著关联。综上，g.71874104 G＞A位点的A等位基因及g.71833755 T＞C位点的C等位基因可能是提高绵羊产羔数潜在有效的DNA标记。