胆囊胆固醇结石患者胆道菌群结构、免疫水平与其结石形成间的关联*

朱卫国 黄继宗 郑小平 李扬智 梁海飞

1.佛冈县人民医院普外科，广东 清远 511600； 2.清远市人民医院肝胆外科，广东 清远 511500

根据相关数据可知，我国胆结石患者的数量逐年增加，尤其是胆囊胆固醇患者的比例很高。能够导致胆囊胆固醇结石的因素有很多，如胆囊运动功能受损、胆固醇胆汁饱和度过高等。在经过溶石治疗之后，患者胆囊胆固醇结石的重复发病风险仍然比较高，同时统一产生各类并发症，如胆囊癌、急性胆囊炎等。在当前临床治疗当中，相关专家认为细菌源性物质能够导致胆囊胆固醇结石的形成，其可影响人体免疫代谢，从而促使病症的发生[1]。本研究就胆囊胆固醇结石患者其结石形成的原因与免疫水平、胆道菌群结构之间的联系进行探讨，深入研究结石是因何而形成。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年8月—2018年9月我院收治的胆囊胆固醇结石患者60例，并作为本次试验的观察组，并选取60例健康者最为本次试验的对照组。入组条件：(1)年龄在20～60岁之间；(2)不限患者性别；(3)患有胆囊胆结石的患者。排除条件：(1)排除患有人类免疫缺陷病毒及各类肝炎患者；(2)排除患有其他消化道病症的患者；(3)排除身患恶性肿瘤的患者；(4)排除患有精神疾病的患者。伦理学标准：(1)将临床研究内容充分告知患者及其直系家属，并签署相关知情同意书；(2)依照相关临床标准及规定监护、诊治入选患者，充分保障患者的生命安全以及医疗治疗的有效性。(3)严格保密入选患者的各类相关信息，使其隐私权被充分保护。(4)该研究试验应该遵守《渥太华工作组关于临床试验注册的声明》。

1.2 方法 对两组研究患者的胆囊粘膜和胆汁DNA的菌落数及阳性率采用半定量PCR的方式进行检测，将其菌群种类作以分析，同时对它们IgM、IgG和IgA含量进行测定。

1.2.1 样品收集 胆汁取样：该研究采取术中胆囊穿刺措施进行；术中需对患者进行开腹手术或者腹腔镜手术进行切除胆囊或切除后，通过无菌注射器将样品胆汁吸出。结石取样：患者进行手术中，需要在不通过碎石的基础上进行收集样本，样本包括胆固醇结石、混合结石；在样本去除后，需要用无菌生理盐水对样本表面进行冲洗，其冲洗力度需要轻柔，主要出去样本表面的附着物即可[2]。粪便收集：在患者实施胆囊结石手术前，需要对患者术前清晨或前一天的粪便进行收集，其粪便属于正常个体样本收集。样品保存：需要研究样本需放置于无菌螺口离心管内，其次需要及时放置于无防腐剂的液氮瓶中，并及时储存，运输途中需要附加干冰，送至中国科学院进行进一步研究分析，其在处理过程中需要将样本放置于原始管中，并处于于-80℃冰箱进行保存。

1.2.2 进行菌群鉴定 (1)采用巢氏扩增(PCR)：PCR扩增产物经过电泳分析、胶回收、纯化。(2)采用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。(3)采用变形梯度凝胶电泳对DNA遗传指纹图谱技术进行检测[3]。

1.2.3 免疫球蛋白含量的试验 (1)胆囊薪模800 mg，测定免疫球蛋白的成分。(2)抽取胆汁样本进行测定。

1.3 观察指标 对两组的细菌DNA检出率、细菌菌落数及免疫球蛋白的测定结果作分析。

2 结 果

2.1 两组患者通过对细菌DNA检出率的分析情况 两组患者在DNA检出率的对比中，观察组的胆汁细菌DNA阳性率与胆囊黏膜细菌DNA阳性率为71.67%和68.33%，两组患者的细菌DNA检出率对比无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组患者在细菌DNA检出率的对比情况[n(%)](n=60)

2.2 两组患者的细菌菌落数的对比情况 根据表2显示，通过对比两组数据，两组胆汁细菌的菌数与胆囊黏膜细菌的菌落数数量相比差异具有统计学意义(P<0.05)；见表2。

表2 两组患者的细菌菌落数的对比情况

2.3 两组病患通过PCR产物中测序的结果显示 两组的细菌DNA阳性病患均有变现出多种细菌混合性感染的现象，其细菌存在的种类为2～5种以上，而两组患者对比，对照组的细菌种类明显少于观察组，两组患者在PCR产物测序结果中差异无统计学意义(P>0.05)；

2.4 两组患者免疫球蛋白含量的对比情况 根据表3显示，两组患者在免疫球蛋白含量的对比中，两组病患在其胆囊胆固醇中胆囊黏膜及胆汁的相关数值对比中，两组IgA、IgG相比差异具有统计学意义(P<0.05)；两组IgM相比差异无统计学意义(P>0.05)；见表3

表3 两组免疫球蛋白摄取含量的分析

3 讨 论

通常来说，临床当中采用常规的细菌培养方法对患者胆囊胆固醇结石的患者进行胆囊粘膜、胆汁及胆石的检测，通过检测数据可知，患者细菌阳性率<25%，故可得出结石的形成与患者胆道内的菌群无关[4]。相关医护人员采用NT-PCR的方法检测细菌，数据显示患者胆汁中的细菌阳性率高达80%[5]。通过采用超速离心方式对采集的结石胆汁与对照组胆汁进行处理，将以进行离心的样本取中间部分3ml并放置与无菌玻璃试管中，并采用偏光显微镜进行观察，如观察未发现胆固醇结晶可进行下一步试验，但在观察中存在胆固醇结晶则需要超速离心重复操作，直到显微镜下无胆固醇结晶，可进行下一步胆汁样品试验[6]。本次试验取结石组胆汁与对照组胆汁置于无菌管中，设置参数为37 ℃ 45 000 rpm，并通过30 min超速离心，将0.22 μm膜过滤，其胆汁量达到480 ml，两组试验均加入20 μl CCCP、白蛋白蛋白、氯化钙,其满足总体积500μl，放置于恒温箱培养，设置温度为37 ℃。带静止30 min后作为试验零点，并通过偏光显微镜进行观察，时间间隔为24 h，直到可观察折光性胆固醇结晶析出为止，并研究标本均出现结晶，则视为试验结束。结束后记录每个样本出现胆固醇结晶的形成时间点[7]。检测时采用PCR的方法进行，则外部因素不会影响到细菌的检测数据，可使其原始资料得以还原。所以说，细菌存在于胆囊胆结石患者中，不能够充分证明结石的形成与其有关[8]。

就患者胆囊薪膜和胆汁中IgG、IgA的含量而言，两组相比有差异性，则可证明患者结石的形成有可能与免疫球蛋白的改变相关。胆固醇成核活性蛋白通过IgG、IgA得以提升，除此之外，免疫球蛋白的分泌了有可能会对患者菌群造成影响，从而形成结石。

总之，胆囊胆固醇结石患者菌群与其相似，结石的形成与细菌的存在并无直接关系，但是患者结石的形成有可能与免疫球蛋白的升高密切相关。