香菇多糖对人结直肠癌上皮细胞SW837免疫原性死亡相关分子表达的影响①

芮 雯 游思远 吴小清 陈鸿策 陈宏远

(广东药科大学基础学院病原生物学与免疫学系，广州510006)

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，每年全球约有136万例患者被确诊为结直肠癌，而约有70万例患者直接或间接死于结直肠癌[1]。在中国，结直肠癌发病率、死亡率在恶性肿瘤中均位居前5，已成为严重危害我国人民健康的疾病。目前，对于结直肠癌主要采取根治性手术切除和化疗为主。近年来，抗 PD-1 免疫治疗的研究结果NCT01876511迎来结直肠癌免疫治疗的突破性进展[2]，肿瘤免疫治疗的兴起为结直肠癌患者带来新的希望。

肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡(Immunogenic cell death，ICD)，是肿瘤细胞经过特定的放化疗或者免疫原性诱导剂处理后，在发生细胞凋亡的同时肿瘤细胞由非免疫原性转变为具有免疫原性[3]，激活免疫系统攻击肿瘤细胞的一种抗肿瘤免疫效应[4]。ICD的发生涉及多种信号分子参与，包括CRT、HSP70、HSP90等，其表达量的变化直接影响肿瘤细胞免疫的过程[5]。

而今植物多糖研究日益受到关注，实验研究显示，许多植物多糖具有调节免疫功能及抑制肿瘤等生物活性[6]。现代医药学研究成果表明,香菇Lentinus edodes(Berk)sing具有增强免疫力、抗肿瘤等功能，香菇多糖是香菇主要生物活性分子之一。香菇多糖现已应用于临床，可用于增强细胞免疫功能，但未见其与结肠癌细胞ICD相关的报道。本文主要采用人结直肠癌上皮细胞SW837为模型，考察香菇多糖体外对SW837细胞存活率及ICD相关分子和共刺激分子等表达量的影响。

1 材料与方法

1.1材料 香菇多糖由本校范华钧教授课题提供，纯度>95 %；人结直肠癌上皮细胞SW837购自美国 ATCC 公司；PBS、DMEM培养基、0.25%胰酶、RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)、青霉素、链霉素等购自美国 Gibco公司；米托蒽醌(Mitoxantrone，MTX)购自美国Selleck生物科技有限公司；BV650标记的鼠抗人CD80单克隆抗体(BV650-CD80)购自美国BD公司；Percp/Cy5.5标记的鼠抗人Galectin9单克隆抗体(Percp/Cy5.5-Galectin9)、PE-TexasRed标记的鼠抗人CD155单克隆抗体(PE-TexasRed-CD155)、BV510标记的鼠抗人CD39单克隆抗体(BV510-CD39)、BV711标记的鼠抗人PDL-1单克隆抗体(BV711-PDL-1)等抗体购自美国Biolegend公司；BV605标记的鼠抗人CD47单克隆抗体(BV605-CD47)购自美国BD公司；APC标记的鼠抗人HSP70单克隆抗体(APC-HSP70)购自英国Biorbyt公司；PE标记的鼠抗人HSP90单克隆抗体(PE-HSP90)购自瑞士Enzo Life Science公司；FITC标记的山羊抗兔IgG二抗和FITC标记的鼠抗人CRT(FITC-CRT)抗体购自英国Abcam公司；CCK8试剂盒购自上海碧云天生物技术公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 SW837细胞采用含10% FBS及青、链霉素双抗的1640培养基，置于37℃、5% CO2培养箱中按常规方法培养。

1.2.2细胞存活率检测与分析 按照CCK8说明书操作。取对数生长期的SW837细胞按1×105个/ml接种于96孔板中，每孔接种100 μl。细胞贴壁24 h后分别加入0.4～4 mg/ml的香菇多糖，每孔重复3次，并设置不加多糖的空白对照组。继续培养48 h后，每孔加入10 μl的CCK8工作液，避光孵育2 h，然后用酶标仪检测各组待检样品在450 nm处的吸光度。

1.2.3肿瘤细胞免疫原性死亡相关分子及共刺激分子的检测 取对数生长期的SW837细胞接种于24孔板中，细胞密度为2.0×105个/ml，每孔接种0.5 ml。细胞贴壁24 h后加入0.2～1 mg/ml的香菇多糖，并设置不加多糖的空白对照组和20 ng/μl MTX的处理组作为阳性对照，每孔重复3次。继续培养48 h后，0.25%的胰酶消化收集细胞，过滤、重悬细胞使其终浓度为1×105个/ml。取100 μl细胞悬液于5 ml离心管中，加入1 μl 50 μg/ml BV650标记的CD80抗体在4℃避光孵育30 min。含1% FBS的PBS洗涤一次后，采用流式细胞仪检测与定量分析各样品中的BV650荧光强度。Galectin9、CD39、CD47、PDL-1、CD155、HSP70、HSP90、CRT等分子的表达检测与分析类似前述方法进行。HSP90、HSP70、CRT分子表达量的检测在多糖处理结束后需要用70%冷乙醇固定30 min后加PBS清洗2次，用1%BSA封闭20 min后，抗体标记检测与分析采用上述类似方法进行。

2 结果

2.1香菇多糖对SW837细胞存活率的影响 0.04～4 mg/ml的香菇多糖处理SW837细胞48 h后，CCK8法检测各实验组细胞存活率的结果表明：香菇多糖对细胞的增殖具有明显抑制作用且具有浓度依赖性，IC50为1.14 g/ml。

图1 不同浓度的香菇多糖对SW837细胞存活率的影响Fig.1 Effect of different concentrations of Letinous edodes polysaccharides on survival rate of SW837 cells

2.2香菇多糖对SW837细胞ICD相关分子表达的影响 以0.2～1 mg/ml的香菇多糖处理细胞48 h后，流式细胞术检测细胞表面ICD相关分子CRT、HSP70、HSP90的表达。结果显示：不同浓度的香菇多糖都能明显诱导SW837细胞CRT、HSP70、HSP90表达量升高(图2～4)。

图2 不同浓度的香菇多糖对SW837细胞表达CRT的影响Fig.2 Effect of Letinous edodes polysaccharides on expression of CRT in SW837 cellsNote：Compared with control group，*.P<0.05，****.P<0.000 1.

图3 不同浓度的香菇多糖对SW837细胞表达HSP90的影响Fig.3 Effect of Letinous edodes polysaccharides on expression of HSP90 in SW837 cellsNote：Compared with control group，*.P<0.05，****.P<0.000 1.

图4 不同浓度的香菇多糖对SW837细胞表达HSP70的影响Fig.4 Effect of Letinous edodes polysaccharides on expression of HSP70 in SW837 cellsNote：Compared with control group，*.P<0.05，****.P<0.000 1.

2.3香菇多糖对免疫检查点相关分子表达的影响 流式细胞术检测结果表明：0.2～1 mg/ml 的香菇多糖都能明显诱导SW837细胞免疫系统功能抑制性蛋白PDL-1、Galectin9、CD155、CD47、CD39表达量升高，且呈现浓度梯度依赖性(图5～9)。

图5 不同浓度的香菇多糖对SW837细胞表达PDL-1的影响Fig.5 Effect of Letinous edodes polysaccharides on PDL-1 expression in SW837 cellsNote：Compared with control group，*.P<0.05，****.P<0.000 1.

图6 不同浓度的香菇多糖对SW837细胞表达Galectin9的影响Fig.6 Effect of Letinous edodes polysaccharides on Galectin9 expression in SW837 cellsNote：Compared with control group，*.P<0.05,****.P<0.000 1.

图7 不同浓度的香菇多糖对SW837细胞表达CD155的影响Fig.7 Effect of Letinous edodes polysaccharides on CD155 expression in SW837 cellsNote：Compared with control group，**.P<0.01，****.P<0.000 1.

图8 不同浓度的香菇多糖对SW837细胞表达CD47的影响Fig.8 Effect of Letinous edodes polysaccharides on CD47 expression in SW837 cellsNote：Compared with control group，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001.

图9 不同浓度的香菇多糖对SW837细胞表达CD39的影响Fig.9 Effect of Letinous edodes polysaccharides on CD39 expression in SW837 cellsNote：Compared with control group，**.P<0.01，***.P<0.001.

图10 香菇多糖对SW837细胞表达CD80的影响Fig.10 Effect of Letinous edodes polysaccharides on CD80 expression in SW837 cellsNote：Compared with control group，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001.

2.4香菇多糖对共刺激分子表达的影响 流式细胞仪检测CD80的结果显示：0.2～1 mg/ml的香菇多糖处理后，实验组的平均荧光强度与对照组相比显著提高，表明香菇多糖能明显诱导SW837细胞共刺激分子CD80表达量升高，且呈现浓度梯度依赖性(图10)。

3 讨论

香菇多糖是从香菇子实体中通过提取、分离和纯化而得到有效活性成分。1970年由日本味之素公司首次开放，并于1988年批准进口我国，作为辅助治疗恶性肿瘤的药物。目前针对香菇多糖已有较多研究，涉及治疗自身免疫功能低下而引起的各种疾病、慢性病毒性肝炎、保肝治疗、作为肿瘤化疗辅助药物等[7]。

ICD的发生是经过某些特定的药物和放射线治疗肿瘤过程中，可增强处于凋亡阶段的肿瘤细胞从非免疫原性细胞转化为免疫原性细胞，进而激活免疫系统，加强机体的抗肿瘤免疫效应[8]。肿瘤细胞ICD的是一种有多种信号分子和细胞因子参与的复杂过程，包括细胞膜表面信号分子表达水平的改变，这些分子的细胞定位和表达水平的改变直接影响肿瘤细胞与免疫细胞，由此决定了肿瘤细胞的免疫原性[9]。

我们曾经考察过香菇多糖对多种肿瘤细胞系，包括HT1299、PC-9、H1975、HLF、SW837、HepG2等不同来源的肿瘤细胞系的ICD相关分子的影响，此次筛选出多糖对SW837细胞的凋亡及免疫调节作用尤为明显。本实验进而采用SW837结肠癌细胞株为模型分别考察了香菇多糖对肿瘤细胞增殖的影响以及其对肿瘤细胞ICD相关分子CRT、HSP70、HSP90的作用。CRT是肿瘤细胞发生免疫原性死亡的重要的标志分子之一[10]。CRT的缺失抑制DC识别经蒽醌类药物处理的肿瘤细胞，重组CRT可以恢复DC对于肿瘤细胞的识别[11-13]。CRT在肿瘤细胞的表达对于DC对肿瘤细胞的识别、激活T细胞具有至关重要的作用[14]。HSPS是细胞在应激原特别是环境高温诱导下所生成的一组蛋白质，肿瘤细胞在经过药物处理发生凋亡的时候，高度保守的HSPS跨膜转位到细胞膜表面，细胞膜表面的HSP70、HSP90可以促进DC对肿瘤细胞的识别和吞噬，促进抗原呈递，激活CD8+T细胞[15]。HSP70、HSP90、CRT表达量升高能诱导肿瘤细胞ICD的发生。

实验还考察了香菇多糖对免疫检查点分子PDL-1、Galectin9、CD155、CD47、CD39表达量的影响，免疫检查点分子通过抑制免疫系统的抗肿瘤效应和促进肿瘤生长。CTLA-4 和 PD-1/PD-L1等封锁免疫检查点分子的治疗方法具有潜在的应用前景[16,17]，而免疫检查点分子的表达成为封锁免疫检查点分子治疗的依据。程序性死亡受体-1(PD-1)可以与程序性死亡受体-配体1(PD-L1)结合，抑制T细胞的激活分化[18，19]。Galectin9与T细胞表面的配体Tim3结合，促进T细胞损耗，抑制T细胞的活性[20]。CD155 是脊髓灰质炎病毒受体，与配体CD226 结合抑制免疫系统的抗肿瘤效应[21,22]。CD47能使肿瘤细胞逃逸巨噬细胞的吞噬，逃逸免疫系统对肿瘤细胞的攻击。CD39参与的外腺苷三磷酸-双磷酸酶信号通路降解维持内环境稳态的ATP分子[20]，抑制免疫系统对肿瘤细胞的杀伤。本实验结果显示经过香菇多糖处理的SW837细胞表面PDL-1、Galectin9、CD155、CD47、CD39分子表达量升高，针对免疫检查点分子设计的特定蛋白质抗体，阻止了PDL-1、Galectin9、CD155、CD47、CD39及其配体的识别过程，恢复部分T细胞功能，从而使T细胞可以杀死肿瘤细胞，我们的实验结果为香菇多糖辅助封锁免疫检测点疗法提供了实验数据。最后我们考察香菇多糖对协同刺激分子CD80表达的影响，CD80作为CTLA-4的配体，其表达量与B细胞活化及T细胞刺激相关[23，24]。

上述实验结果为香菇多糖抗结直肠癌免疫提供了体外实验的依据，后续将体内动物模型方面做出详尽的实验探讨，丰富多糖通过免疫调节抗癌的实验研究。