青稞-绿豆格瓦斯的制备及其抗氧化活性研究

潘云峰, 张楷正, 伍文驰, 李琼, 宿友志

(四川轻化工大学生物工程学院， 四川自贡643000)

引言

青稞属禾本科大麦属，是青藏高原最具特色的农作物，具有丰富的营养价值和一定的保健效果。每100 g青稞产热量高达357 千卡，富含蛋白质、脂肪、碳水化合物、淀粉，钙、磷、铁等微量元素含量也较高，并含有多种氨基酸和膳食纤维[1]。青稞被广泛用来酿制青稞酒、咂酒[2]、啤酒以及青稞饼干[3]。

绿豆含有淀粉、蛋白质、膳食纤维、β-胡萝卜素、维生素E、钙、钾、镁、铁、锌、硒等营养元素，还含有低聚糖、黄酮类、酚类化合物和豆固醇等功能成分[4]，具有较高的营养与保健价值。氧化过程被视为人体中许多慢性疾病(如癌症、心血管疾病、动脉硬化和糖尿病)的最初发展步骤之一[5]，而黄酮类化合物具有较好的抗氧化及抗肿瘤功效[6-7]。研究还表明绿豆中的黄酮类物质具有缓解热应激的作用[8]，因而可以起到解暑的功效。

格瓦斯原产于俄国。传统格瓦斯是以面包或麦芽为原料，经自然发酵后产生的一种低酒度(小于1%)饮料[9]，具有风味甘美、口感醇香微甜等特点，此外还具有健脾、降血压、开胃、消除疲劳等作用[10]。目前市场上已经形成多种格瓦斯的工业化生产，其基本方法都是以小麦芽汁或面包浸提液为原料，经添加乳酸菌或酵母菌发酵而成[11]。

为了丰富格瓦斯的品种和加强其保健功效，本文以青稞、绿豆为原料，干燥粉碎后，接种酵母菌和乳酸菌进行发酵，通过单因素实验和正交实验，确定最佳发酵条件，得到新型的青稞-绿豆格瓦斯(HM-K)饮料。有研究发现青稞酒含有促进人体健康的有益功效物质[12]，而本文制作的青稞-绿豆格瓦斯与其一样都以青稞等谷物为原料经发酵而成，由此推测HM-K可能也具有一定的抗氧化功效。本文测定了青稞-绿豆格瓦斯的总抗氧化力、还原力以及两种自由基的清除能力，并检测了其总黄酮、总酚类物质的含量，由此初步探究其保健作用，并为进一步优化其生产发酵工艺、研究其对人体的抗氧化及防暑解暑功效打下一定的实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料：青稞，产于四川省甘孜州泸定县；绿豆，购于自贡沃尔玛超市。

发酵菌剂：啤酒酵母、生香酵母和葡萄酒酵母，均购于安琪酵母有限公司；保加利亚乳杆菌和双歧杆菌，均购于北京川秀贸易有限公司。

青稞格瓦斯(HB-K)：实验室自制，与青稞绿豆格瓦斯(HM-K)的制作工艺相同，两者只是在原料上有所区别，前者仅以青稞为原料，后者除了青稞外还有绿豆。将两者进行对比来探究发酵原料对产品质量的影响。

市售格瓦斯样品：WH-K和QL-K，均购于自贡沃尔玛超市。WH-K的主要原料为：水、果葡糖浆、白砂糖、浓缩麦芽汁、乳酸菌和其他食品添加剂；QL-K的主要原料为：水、面包提取液、乳酸菌、酵母菌、白砂糖和啤酒花。

试剂：没食子酸、抗坏血酸、1,10-菲啰啉、三氯化铁、芦丁标准品、福林-酚试剂、丁基羟基茴香醚、铁氰化钾、硫酸亚铁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、酚酞、氢氧化钠和30%过氧化氢，均产自成都科龙化工有限公司；DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；总抗氧化能力测定试剂盒，南京建成生物有限公司；α-淀粉酶和糖化酶，北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 仪器设备

紫外可见光分光光度计：T6新世纪，北京普析通用仪器有限责任公司；生化培养箱：SHP-250(E) ，上海培因实验室仪器有限公司；离心机：RJ-TGL-1850，无锡市瑞江分析仪器有限公司；粉碎机：FW-80，天津泰斯特仪器有限公司；电子天平：FA1004，常州市衡正电子仪器有限公司；手持酒精计：HYJJ5，北京华运安特科技有限责任公司；pH测定仪：PHSJ-3F，上海精密科学仪器有限公司；手持糖度计：WZ101，海南博汉森科技开发有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1青稞-绿豆格瓦斯(HM-K)的制作工艺

HM-K的工艺流程如图1 所示。

图1 青稞-绿豆格瓦斯(HM-K)的制作工艺流程

HM-K的制作工艺要点：将青稞放入干燥箱中于60 ℃下干燥8 h，绿豆150 ℃烘焙15 min，两者粉碎后混合，加水，100 ℃煮沸10 min进行糊化，冷却至55 ℃～60 ℃，加入α-淀粉酶，58 ℃液化1 h，加入糖化酶，60 ℃糖化6 h，过滤，滤液经100 ℃煮沸10 min进行灭酶，冷却，接种等量的活化乳酸菌和酵母菌发酵剂，30 ℃发酵24 h，过滤，80 ℃灭菌10 min，放入2 ℃冰箱冷藏8 h，即得HM-K。

1.3.2HM-K发酵工艺的优化

(1)发酵菌种的选择

设双岐乳杆菌为A，保加利亚乳杆菌为B，啤酒酵母为C，生香酵母为D，葡萄酒酵母为E，比较A+C(AC)、A+D(AD)、A+E(AE)、B+C(BC)、B+D(BD)、B+E(BE)等组合发酵下，格瓦斯的酒精度、酸度、还原糖和感官评分，由此选择最优的菌种组合。其他条件为：乳酸菌和酵母菌总接种量为0.2%(两者各为0.1%)，发酵时间为24 h，发酵温度为30 ℃。

(2)同步发酵法发与异步发酵法的比较

其他发酵条件相同的情况下，分别采用同步发酵法(酵母菌和乳酸菌同时加入)和异步发酵法(酵母菌和乳酸菌分两步加入)，比较两种发酵产品的理化指标和感官品指标，由此确定发酵方法。

(3)单因素实验与正交实验

通过单因素实验确定原料配比(青稞∶绿豆)、发酵时间、发酵温度、菌剂添加量对格瓦斯质量的影响，在此基础上，采用设计L9(34)正交试验进一步优化发酵工艺。

1.3.3产品理化和感官指标检测

还原糖：滴定法测定；pH值：pH计测定；糖度：手持糖度计测定；酸度：NaOH滴定法测定；酒精度：酒精计测定。

感官评定：参照新疆维吾尔自治区地方标准DB65/T2828-2008(发酵风味饮料-格瓦斯)，在此基础上，进行了一定完善，见表1。从青稞-绿豆格瓦斯的滋味、气味、外观、典型性四个指标评定其品质，满分20分，由10位具有一定专业知识的人员来进行评定。

表1 青稞绿豆格瓦斯感官评分标准

1.3.4抗氧化活性研究

(1)DPPH自由基清除能力测定

DPPH自由基清除能力的测定参照文献[13]，在此基础上，进行了一定优化，具体为：取5 mL不同浓度样液(分别含原液0.1 mL、0.2 mL和0.3 mL)，加入5 mL DPPH-乙醇溶液(0.1 mmol/L)，室温下避光反应30 min，用分光光度计在波长为525 nm处测其光度值A1。另用5 mL乙醇(95%)代替5 mL样液作为空白对照，用上述方法测得空白对照的光度值A0。检测时，用95%乙醇调零。样液吸光度小，则代表其清除DPPH能力强。DPPH自由基清除能力的计算式为：

(1)

(2)羟基自由基(·OH)清除能力测定

羟基自由基(·OH)清除能力的测定参照文献[14]，在此基础上，进行了一定优化，具体为：吸取1 mL1,10-菲啰啉无水乙醇溶液(5 mmol/L)于比色管中，加入2 mL的磷酸缓冲溶液(0.2 mol/L，pH=7.4)，分别加入0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL样液，充分混匀，加入1 mLFeSO4溶液(5 mmol/L)和1 mL过氧化氢(0.1%)，37 ℃恒温水浴保温1 h，用蒸馏水定容至10 mL，在536 nm处测得吸光度A2。另用1 mL蒸馏水代替1 mL样液，得到损伤管，在536 nm处测得吸光度A3；再用2mL蒸馏水代替1 mL样液和1 mL过氧化氢，得到未损伤管，在536 nm处测得吸光度A4。羟基自由基(·OH)清除能力的计算式为：

(2)

(3)还原能力的测定

还原能力的测定参照以文献[15]，在此基础上，进行了一定优化，具体为：在1 mL不同浓度样品(分别含原液0.1 mL、0.2 mL和0.3 mL)中加入2.5 mL磷酸缓冲液(0.2 mol/L，pH=6.8)和2.5 mL铁氰化钾溶液(1 g/100 mL)，50 ℃下反应20 min后，加入2.5 mL三氯乙酸(100 g/L)，3000 r/min下离心10 min ，取上清液3 mL，加3 mL去离子水和0.6 mL氯化铁(1 g/L)，在700 nm处测其吸光度A6。另以1 mL纯水代替1 mL样液，用上述同样方法测吸光度A5作空白对照。以BHA溶液(0.5 g/L)和抗坏血酸溶液(0.2 mmol/L)作阳性对照。样液的吸光度越大，代表其还原能力越好。

(4)总抗氧化力的测定

总抗氧化力用南京建成生物工程研究所的T-AOC(总抗氧化力)试剂盒来进行测定。该试剂盒可稳定且快速地测量样品的自由基清除能力。37 ℃时，每毫升样品液每分钟使反应体系的吸光度值每增加0.01作为一个抗氧化能力单位(U)。以BHA溶液(0.5 g/L)和抗坏血酸溶液(0.2 mmol/L)作阳性对照。样液的OD值高，代表其总抗氧能力强。

1.3.5总酚和总黄酮的测定

总酚的测定参照文献[16]进行，在此基础上，进行了一定优化，具体为：将1 mL样品液用45 mL蒸馏水稀释，加入1 mL福林-酚试剂，充分混合，3 min后加入3 mL Na2CO3(20g/L)，30 ℃温育1.5 h并间歇震荡，在760 nm处测其吸光度。样品中总酚的计算式为：

(3)

总黄酮含量的测定的方法为：将1 mL离心后的样品上清液置于25 mL比色管中，加入0.3 mL NaNO2溶液(5%)，摇匀，放置7 min，加入0.3 mL Al(NO3)3溶液(10%)，摇匀，放置7 min，加入4 mL NaOH溶液(4%)，并用蒸馏水定容至10 mL，摇匀，在510 nm处测其吸光值。样品中总黄酮的计算式为：

(4)

1.3.6数据处理

每个实验进行三次平行实验，结果用平均值±标准差来表示；实验数据采用SPSS 19.0软件进行One-Way ANOVA 及 Duncan 分析，P< 0.05代表差异显著。

2 结果与讨论

2.1 HM-K发酵工艺的优化

2.1.1发酵菌种的选择

不同发酵菌种组合下格瓦斯感官评分如图2 所示。

注：(1)A为双岐乳杆菌，B为保加利亚乳杆菌，C为面包酵母，D为啤酒酵母，E为葡萄酒酵母。(2)误差棒上的小写字母不同表示差异显著(p<0.05)，相同则差异不显著。

图2 不同发酵菌种组合的HM-K感官评分

从图2 可知，菌种组合BD(保加利亚乳杆菌与生香酵母组合)发酵所得HM-K的感官评分最高，与其他五种菌种组合之间具有显著性差异(p<0.05)，因此选择保加利亚乳杆菌和生香酵母作为HM-K的混合发酵菌种。

2.1.2同步法、异步法发酵工艺的确定

同步发酵法与异步发酵法对HM-K品质的影响见表2。

表2 同步发酵法与异步发酵法对HM-K品质的影响

从表2可知，两种发酵法所得产品的感官评分相差不大；此外，同步发酵法制备的HM-K的酒精度高于异步发酵法的，还原糖含量的情况则相反，这是因为同步法中酵母菌接入时间较长，发酵体系中的还原糖被利用得更彻底，产生的酒精更多；再者，异步发酵法制备的HM-K的酸度略高于同步发酵法的，这是因为异步发酵法中先接入乳酸菌，其生长的时间较同步法中更长，因此产生更多的乳酸使得酸度增加。综上所述，并且考虑到同步发酵法操作更加简单，而异步法的分步添加菌种会增大杂菌污染几率，因此选择同步发酵法进行后续的研究。

2.1.3单因素实验

设计单因素实验，分别研究青稞与绿豆的比例(5∶5、6∶4、7∶3、8∶2和9∶1)、发酵温度(28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃和36 ℃)、发酵时间(6 h、12 h、18 h、24 h和30 h)、菌剂添加量(0.10%、0.15%、0.20%、0.25%和0.30%)对HM-K品质的影响。单因素实验对HM-K感官评分的影响如图3 所示，误差棒上的小写字母不同代表差异显著(p<0.05)，相同则差异不显著。

图3 单因素实验结果

从图3 (a)～3(d) 可知，单因素实验的结果表明适宜的发酵条件是：青稞与绿豆的比例7∶3、发酵时间24 h、发酵温度30 ℃、菌剂添加量0.2%。

2.1.4正交试验及验证

在单因素实验的基础上，选择原料比、发酵时间、菌剂添加量和发酵温度4种因素，设计L9(34)正交试验对发酵工艺进行进一步地优化，试验因素与水平见表3，正交试验结果见表4。

表3 HM-K发酵工艺正交试验因素与水平

注：A为原料比(青稞∶绿豆)，B为发酵时间，C为菌种添加量，D为发酵温度。

从表4可知，4个因素对HM-K感官评分的影响按大小排列依次为A(原料比)>D(发酵温度)>B(发酵时间)=C(菌剂添加量)，最优发酵条件为A2B2C3D2，即青稞与绿豆比例为7∶3，发酵时间为24 h，菌剂添加量为0.25%，发酵温度为30 ℃。

表4 正交试验结果与分析

注：A为原料比(青稞∶绿豆)，B为发酵时间，C为菌种添加量，D为发酵温度。

做三个平行实验，对最优发酵条件A2B2C3D2进行验证，所得青稞-绿豆格瓦斯(HM-K)呈棕黄色，明亮有光泽，酸味适宜，酯香味和醇香味突出，有青稞和绿豆特有的香味，无杂质沉淀，摇动有较多气泡，酸甜适宜，口感纯正，有较强杀口性，感官评分为16.8±1.3a，高于正交试验中的最高感官评分15.1±2.1b(表4)，说明正交试验的结果是正确的。

2.2 抗氧化活性研究

2.2.1DPPH自由基清除力

DPPH是一种很稳定的自由基，可以捕获(清除)其他自由基[17]。DPPH自由基的吸收波长在520 nm左右，在本实验中，最大吸收波长确定为525 nm，用0.5 g/L的BHA溶液和0.17 g/L的没食子酸(Gallic Aci)作阳性对照。样液吸光度小，则代表其DPPH清除能力强。

四种格瓦斯与阳性对照BHA和没食子酸的DPPH自由基清除率如图4 所示，清除率越高表示DPPH清除活性越强；100 μL、200 μL和300 μL代表样品液的量；误差棒上的小写字母不同表示差异显著(p<0.05)，相同则差异不显著。

图4 四种格瓦斯、BHA和没食子酸对DPPH自由基的清除率

从图4 可知，HM-K与HB-K都具有较强的DPPH自由基清除能力，明显高于QL-K和WH-K，其中HM-K的DPPH自由基清除能力在四中格瓦斯中是最强的且高于阳性对照BHA，不过低于阳性对照没食子酸；所有样品的DPPH自由基清除率都随样品量的增加而增加，在样品含量为300 μl时，HB-K、HM-K、QL-K、WH-K、BHA和Gallic Acid的DPPH自由基清除率分别为：66.51%、76.55%、13.12%、14.32%、58.60%和91.12%。HM-K的DPPH自由基清除率高于HB-K，原因可能是其原料中加入了30%的绿豆，有研究表明绿豆皮中富含黄酮类物质[18]，而黄酮类物质具有良好的抗氧化活性[13]，由此推测是绿豆导致了HB-K与HM-K间的DPPH自由基清除力差异。

2.2.2羟基自由基(·OH-)的清除力

羟基自由基是一种氧化活性极强的自由基，在人体内会对器官造成伤害，它具有最高的单电子还原电位(2310 mV)，可以与脂质、多肽、蛋白质和DNA反应。检测样品对羟基自由基的清除活性可作为衡量其抗氧化活性的方法[19]。用0.5 g/L的BHA溶液和0.2 mmol/L的抗坏血酸(Ascorbic Acid)作阳性对照。

四种格瓦斯和BHA、Ascorbic acid的羟基自由基清除率如图5 所示，清除率越高表示样品的清除活性越强，误差棒上的小写字母不同表示差异显著(p<0.05)，相同则差异不显著。

图5 四种格瓦斯和BHA、Ascorbic acid的羟基自由基清除率

从图5 可知，四种格瓦斯的羟基自由基清除率都不高，明显低于阳性对照BHA和Gallic Acid(p<0.05)；样品含量为300 μL时，HM-K、HB-K、WH-K和QL-K的清除率分别为16.14%、15.14%、6.33%和7.83%，HM-K的值最高，其次是HB-K，两者明显高于WH-K和QL-K(p<0.05)；对同一样品来说，随其添加量的增加，清除率虽有所增加但变化不明显，如HM-K在样品量为100 μL、200 μL、300 μL时，清除率分别为12.11%、14.21%和16.14%。

2.2.3还原能力

抗氧化剂(还原剂)是通过自身的还原作用给出电子而清除自由基，其还原能力越强则抗氧化性越强。在低pH溶液中Fe3+被抗氧化剂还原成Fe2+，使反应液变成深蓝色，在700 nm处有最大吸收，可通过吸光度大小来判定抗氧化剂还原能力，吸光度越大，则还原能力越强。用0.5 g/L的BHA溶液和0.2 mmol/L的抗坏血酸(Ascorbic acid)作阳性对照。

四种格瓦斯和BHA、Ascorbic Acid的还原力(以吸光度表示)如图6 所示，误差棒上的小写字母不同表示差异显著(p<0.05)，相同则差异不显著。

图6 四种格瓦斯和BHA、Ascorbic Acid的还原力

从图6 可知，四种格瓦斯的还原力随其样品量的增加而显著增加(p<0.05)；HM-K的还原能力均高于其他三种格瓦斯，特别是明显高于WH-K与QL-K(p<0.05)，但低于阳性对照BHA和Ascorbic acid(p<0.05)。

2.2.4总抗氧化力(T-AOC)

用总抗氧化试剂盒来测定总抗氧化力，测得的值越大则表示总抗氧化力越强。四种格瓦斯和阳性对照BHA与抗坏血酸(Ascorbic Acid)的总抗氧化力如图7 所示，误差棒上的小写字母不同表示样品间差异显著性(p<0.05)，相同则表示差异不显著。

图7 四种格瓦斯、BHA和Ascorbic Acid的总抗氧化力

从图7 可知，HB-K、HM-K、WH-K、QL-K、BHA和Ascorbic Acid的总抗氧化力分别为16.21 U/mL、19.14 U/mL、2.91 U/mL、3.82 U/mL、16.47 U/mL、10.61 U/mL，HM-K和HB-K总抗氧化力较高，其中HM-K的总抗氧化力明显大于其他格瓦斯样品(p<0.05)，且比阳性对照BHA和Ascorbic Acid的总抗氧化力高(p<0.05)。WH-K与QL-K的总抗氧化力相近但明显低于HB-K与HM-K，推测这主要是由于原料与发酵工艺的差异所引起的，而HB-K、HM-K的总抗氧化力差异可能也是主要源于原料的差异，由此说明原料是影响格瓦斯抗氧化活性的主要原因。

2.3 总黄酮和总酚含量检测

四种格瓦斯的总黄酮和总酚含量见表5，小写字母不同表示样品间差异显著(p<0.05)，相同则差异不显著。

表5 四种格瓦斯的总黄酮和总酚含量

从表5可知，HM-K的总黄酮含量最高，其次是HB-K，两者明显高于WH-K和QL-KD(p<0.05)，HM-K与HB-K的总黄酮含量间也存在显著差异(p<0.05)；而HM-K与HB-K的总酚含量差距不大，但都明显高于其他两种市售格瓦斯(p<0.05)。可能是原料和发酵工艺的差异造成了上述差异。

有研究表明，啤酒中的酚类化合物主要来源于酿造原料大麦麦芽和啤酒花[20]，而HM-K和HB-K的制备工艺与啤酒类似，由此推断其酚类和黄酮类也是主要源于原料青稞与绿豆。黄酮和酚类都具有良好抗氧化功效，据此推测格瓦斯样品间的DPPH自由基清除力、羟基自由基清除率、还原力和总抗氧化力所表现出的差异，是由其总黄酮和总酚含量上的差异所引起的，而原料的差异是导致总黄酮和总酚含量差异的主因。

3 结论

为了丰富格瓦斯的品种和加强其保健功能，以青稞和绿豆为原料，通过发酵来制备新型的青稞-绿豆格瓦斯(HM-K)，设计单因素和正交试验对其发酵工艺进行优化，并对其抗氧化特性和抗氧化机理展开研究，与其他三种格瓦斯品种进行了对比。研究结果发现：

(1)HM-K的最佳发酵工艺是：选择同步发酵法，以保加利亚乳杆菌与生香酵母为混合发酵剂，青稞与绿豆比例为7∶3，添加菌剂量为0.25%(两种菌各为0.125%)，发酵温度为30 ℃，发酵时间为24 h，所得青稞绿豆格瓦斯产品呈棕黄色，明亮有光泽，酸味适宜，酯香和醇香味突出，有青稞和绿豆特有的香味，有较多气泡，杀口性较强。

(2)HM-K与HB-K具有较高的DPPH自由基清除力、羟基自由基(·OH-)清除力、还原力和总抗氧化力，特别是HM-K皆明显高于WH-K与QL-K(p<0.05)。

(3)HM-K的总黄酮含量最高(125.21 mg/L)，其次是HB-K(97.46 mg/L)，两者明显高于WH-K和QL-K(p<0.05)，HM-K与HB-K的总黄酮含量间也存在显著差异(p<0.05)；而HM-K(137.46 mg/L)与HB-K(135.21 mg/L)的总酚含量差距不大，但都明显高于WH-K和QL-K(p<0.05)。

四种格瓦斯样品间的抗氧化特性差异可能是由其总黄酮和总酚含量的差异所引起的，而原料和发酵工艺的差异则可能是导致总黄酮和总酚含量差异的主因。本研究为新型格瓦斯饮料的发酵工艺、保健功效研究提供了一定的参考。