高效液相色谱仪法检测乳酸链球菌素含量的研究

胡小立 王淑霞 郭向阳 卢珊珊 霍 巍

双汇集团技术中心 河南漯河 462003

天然保鲜剂具有无毒、安全、价格合理、环保、抗菌性强等特点，天然保鲜剂的开发研究深受科学家的重视。乳酸链球菌素是由乳酸链球菌产生的一种天然食品防腐剂，乳酸链球菌素(Nisin)是由三十多个氨基酸残基组成的多肽，可抑制肉毒梭菌、单增李斯特菌属和大多数革兰氏阳性细菌，并对芽孢杆菌的孢子有强烈的抑制作用[1～6]，乳酸链球菌素通过降低腐败菌细胞膜磷脂数量，抑制细胞膜孔道的形成，阻碍膜内外的信息与能量传递，破坏细胞膜结构，进而抑制腐败菌生长[7]。乳酸链球菌素食用后，在人体生理pH条件和α-胰凝乳蛋白酶作用下很快水解成氨基酸，不会改变人体肠道内正常菌群，也不会产生如其它抗菌素所出现的抗性问题，更不会与其它抗菌素出现交叉抗性，因此对人体安全无毒副作用，是一种安全、绿色、环保的防腐剂[8～11]。乳酸链球菌素在GB2760[12]中仅规定了的最大使用量，最大使用量达0.5g/kg，可以广泛应用于乳及乳制品、预制肉制品、熟肉制品、蛋制品、复合调味料、饮料等食品行业，安全系数高。

市售乳酸链球菌素含量不一，含量决定乳酸链球菌素的效价，并且其热稳定性易受温度、pH、基质等影响，进而在一定程度上限制了Nisin在食品热加工中的应用，影响最终抑菌效果[13]。最常用的测定方法是琼脂扩散法和显色法[14，15]，此两种方法步骤繁琐，检测周期长，且受菌种活力、菌悬液浓度、培养基质量等诸多因素的影响，检测结果不稳定，检测误差大的缺点，影响售卖价格。刘珈伶[16](2018)等建立了高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)同时测定鲜湿米粉中乳酸链球菌素A(Nisin A)和乳酸链球菌素Z(Nisin Z)的分析方法，但检测仪器成本高，通用性差，且只能检测Nisin A、Nisin Z两种类型，而已知的乳酸链球菌素共有6种类型[17，18]，无法准确反映乳酸链球菌素整体含量。另外，孟茹[19](2013)等建立了酶联免疫吸附法来检测乳制品、肉制品和含乳饮料中的乳酸链球菌素的含量，但该法需要进行免疫原、多克隆抗体的制备，其中多克隆抗体的制备需要动物免疫，直到获得满意的抗体效价为止，然后再采集抗血清，进行纯化后才能进一步检测，过程复杂，检测成本高。

高效液相色谱法是目前应用最多的色谱分析方法，是一种快速有效的有机化合物分析技术[20，21]，能够实现目标物的有效分离分析，提高检测精准度，在环境监测、卫生防疫、石油化工、食品生产等行业广泛应用，检测成本也在大部分企业接受能力范围之内。本试验研究建立利用高效液相色谱仪快速检测乳酸链球菌素含量的方法，降低检测成本，提高检测效率。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与设备

高效液相色谱：配AgiLent色谱工作站、自动进样器、真空脱气机、四元泵和紫外检测器。

1.2 试剂与耗材

除非另有说明，试验用水为液相专用纯化水或娃哈哈纯净水。

1.2.1 试剂

三氟乙酸：分析纯。

磷酸氢二钾：分析纯。

乳酸链球菌素标准品：效价1026IU/mg，麦克林。

流动相(A：0.25%；磷酸氢二钾溶液：称取2.5g磷酸氢二钾加水溶解，用三氟乙酸调pH值至2.1，转移定容至1 000mL容量瓶中，摇匀备用；B：乙腈，色谱纯)。

1.2.2 乳酸链球菌素标准储备液(20mg/mL)

准确称取0.2000g(精确至0.0001g)乳酸链球菌素标准品于10mL容量瓶中，用0.02mol/L盐酸溶液超声溶解5min，定容至刻度，混匀备用。

1.3 仪器条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱:艾杰尔ASB-C18(4.6mm×250mm,5μm)。

流动相：A∶B=60∶40。

进样量：20μL。

检测波长：220μm。

柱温：室温。

流速：0.5mL/min。

1.3.2 测定条件

按照1.3.1液相色谱检测条件对标准工作溶液及样液等体积进样测定，样品中待测物含量应在标准曲线浓度范围之内，如果含量超出标准曲线浓度范围，应适当稀释后再进行上机测定。

1.4 实验步骤

1.4.1 样品处理

称取适量样品于容量瓶中，用0.02mol/L盐酸溶液超声溶解5min，定容至25mL容量瓶中。混匀后用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液备用。

1.4.2 色谱柱选择

色谱柱是色谱系统的心脏，对色谱柱的要求是：柱效高、选择性好，分析速度快[22，23]等。正确选择色谱柱能够达到较好的分离效果，不同基质的色谱柱对样品的分离效果不同，实验中需要根据目标分析物性质(如分子量大小、溶解度、Pka)、分离要求、仪器、成本等各方面要求选择合适的色谱柱[24]。乳酸链球菌素分子量在3 500Da左右，属于大分子类物质，色谱柱的尺寸、颗粒形状及粒径、颗粒表面积、孔径、封端技术等对其分离度有决定性影响，因此选择实验室常用XDB-C18、SB-C18、ASB-C18等色谱柱对乳酸链球菌素标准品进行分离研究，以便找出合适的色谱柱。

1.4.3 流动相的选择

流动相对组分具有很强的亲和力，并且与固定相共同竞争组分，流动相的种类及配比直接影响到组分的分离[25]。其中缓冲盐的种类、pH值和浓度直接影响缓冲盐的离子强度，而流动相的离子强度对可解离化合物的色谱峰形具有显著影响；有机溶剂的种类和配比决定流动相的极性，即洗脱能力，这对出峰时间、峰形、分离度等有着不可忽视的作用。因此需要对流动相组成选择优化。

1.4.4 标准曲线制作

有研究发现[26，27]，经过一些处理，如螯合剂处理、冷冻、高压、降低pH值等，Nisin即可显示出对沙门杆菌、假单胞杆菌、拟杆菌、放线杆菌、大肠杆菌等革兰氏阴性菌抗菌作用明显增强。云雪霞[28](2006)等的研究也表明，EDTA作为螯合剂与Nisin联合应用，可明显地抑菌大肠杆菌生长，且随Nisin浓度增加和作用时间延长抑菌作用明显增强，因此乳酸链球菌素成品基质复杂，且考虑到其相互作用，标准品配置时浓度需要较高，将乳酸链球菌素标准储备液用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液用0.02mol/L盐酸溶液稀释至1、5、10、15、20mg/mL备用。

1.4.5 乳酸链球菌素效价按下式计算：

式中：

C测-标准曲线测得的样液中乳酸链球菌素的质量浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)；

C称-称样时样液中乳酸链球菌素的质量浓度，单位为毫升毫克每毫升(mg/mL)；

注：效价单位为IU/mg，试样中的乳酸链球菌素含量采用色谱数据处理系统计算。

计算结果扣除空白值，保留整数。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱选择与维护

经过对比研究，ASB-C18色谱柱适用于低pH值，具有较高极性，无封端，耐酸性好，对乳酸链球菌素分离柱效高、选择性好,分析速度快，因此选择ASB-C18色谱柱进行乳酸链球菌素含量的研究。液相色谱柱的价格相对较贵，平均使用寿命为6～12个月。随着使用时间增长、进样次数的增加，往往会出现色谱柱柱效降低的想象，如色谱峰峰高降低、峰宽增宽、分离效果降低、峰形不流畅的情况，甚至出现裂峰、肩峰、拖尾峰等情况[29]，给日常的分析工作带来一定的困难。因此为提高色谱柱的使用寿命，降低成本，需要做好色谱柱的日常维护工作[30]：分析实验前，用10～20倍柱体积的流动相平衡色谱柱；最好使用流动相来溶解样品；实验结束用合适的容积进行充分清洗，同时按照色谱柱使用说明书中指明的溶剂来填充色谱柱，并用柱头将色谱柱两端拧紧。

2.2 流动相的选择

为考察不同酸对乳酸链球菌素在C18柱上保留行为的影响，分别利用甲酸、乙酸、盐酸、三氟乙酸对流动相A调pH值至2左右进行试验，结果发现甲酸、乙酸、盐酸等分离效果差，甚至无法分离，三氟乙酸调pH值后分离效果较好；为选择最佳洗脱条件，分别选择甲醇水、乙腈水、磷酸氢二铵与乙腈洗脱体系，设置不同的洗脱程序进行试验，最终表明流动相A和B体积比为60∶40时，乳酸链球菌素目标峰出峰稳定，峰形好，且与杂质峰分离度好；本实验还考察温度、流速对乳酸链球菌素保留行为的影响，温度对乳酸链球菌素的保留时间影响差别不明显，但流速对保留时间影响较大，流速快，目标峰保留时间靠前，无法与杂质峰分开。综上所述，选择三氟乙酸进行pH值调节，流动相A与B等梯度洗脱(体积比60∶40)，流速0.5mL/min。

2.3 标准曲线制作

以仪器峰面积Y对乳酸链球菌素标准溶液浓度x(mg/mL)作标准曲线(如图1)。其回归方程为Y=340.118973x+35.202113，相关系数r2=0.99973，说明在乳酸链球菌素质量浓度为1～20mg/mL范围内，乳酸链球菌素的质量浓度与峰面积之间具有良好的线性关系。

图1 乳酸链球菌素标准曲线Fig. 1 StandardCurve of Nisin

2.4 乳酸链球菌素标准物质、样品色谱图

等度洗脱条件下(磷酸氢二钾溶液与乙腈比例为60∶40)，乳酸链球菌素标准品、样品色谱图分别如图2和图3，由图可知：乳酸链球菌素标准品和样品中标准品物质峰能和杂质峰区分开，可以进行准确积分计算含量。

图2 乳酸链球菌素标准物质色谱图Fig. 2 Chromatogram of Standard Substance of Nisin

图3 乳酸链球菌素样品色谱图Fig. 3 Chromatogram of Sample of Nisin

2.5 方法回收率及检出限

在乳酸链球菌素样品中添加乳酸链球菌素标准品，计算其加标回收率、RSD值及检出限。由表1结果可知：样品加标回收率达90%以上，其RSD值小于5%，以3倍信噪比计算检出限为0.5mg/mL。具体检测数据见表1。

表1 样品加标回收率及RSD值

2.6 稳定性研究

同批次上机检测样品稳定性较好(如表2)，检测值RSD均小于5%，但因乳酸链球菌素溶解度受pH、样品基质等因素影响，样品保留时间稍有差异。

究其原因为乳酸链球菌素应用到食品当中时，由于能与食物中一些组分相互作用，其抗菌活性会大大降低。

张子杰[31〗(2014)研究发现乳酸链球菌素本身可以和许多活性物质联合作用，发挥协同效应,克服抗菌谱窄的不足；杜琨[32](2018)以金黄色葡萄球菌为指示菌，研究发现氯化钠、乙醇和蛋白酶K对乳酸链球菌素的活性有增强作用，食品中的酪蛋白、卵磷脂和木瓜蛋白酶则对乳酸链球菌素的活性有负面影响，而胃蛋白酶和胰腺蛋白酶对乳酸链球菌素的活性没有显著影响；熊玲[33](2012)等研究发现磷酸盐、EDTA二钠、柠檬酸钠对Nisin的抑菌活性保护作用较显著。

综合考虑乳酸链球菌素基体成分对其活性的影响，本文计算效价时，乳酸链球菌素活性按百分之百计算。

表2 乳酸链球菌素稳定性研究

2.7 准确性研究

利用琼脂分散法检测Nisin的效价是由英国Aplin&Barrett公司的Tramer,J.&Fowler,G.G1964[14]在学术期刊上发表的，该方法成为国际公认的Nisin效价检测法。本实验检测值通过与国标琼脂分散法[34](GB1886.231-2016)检测值对比，可看出其准确度可靠，与国标法检测值误差小于10%，说明此方法可用于乳酸链球菌素含量的检测，具体数值见表3。

表3 乳酸链球菌素效价液相法与国标法对比

3 结论

(1)乳酸链球菌素纯度低，需要称样量较大才能达到检测限，若能对其进行进一步纯化，可大大提高检出限，使其应用于乳酸链球菌素含量低的样品检测。乳酸链球菌素的提取纯化主要有有机溶剂法、吸附法和柱层析法：李健武[35](2000)等利用正丙醇、丙酮、乙酸等有机溶剂沉淀Nisin，再经盐析，反复沉淀、溶解的过程，是一种经典方法，但其缺点是回收率低，回收产物活性低；吸附法[36]其一是利用乳酸菌对Nisin具有一定的吸附作用，再净化，还有另一种吸附法是应用一些吸附剂在合适条件下使其与Nisin吸附以达到提取纯化的目的；柱层析法[37]则是传统的层析方法-免疫亲和层析的应用。

(2)乳酸链球菌素标准曲线线性关系良好，其回归方程为Y=340.118973x+35.202113，相关系数r2=0.99973，稳定性较好(RSD<5%)，准确度可信，样品上机检测只需要十几分钟即可，因此可以利用高效液相色谱仪法快速检测乳酸链球菌素含量。

(3)乳酸链球菌素含量和效价成正相关，可以根据样品含量计算出其对应效价。此法前处理操作步骤简单，所用仪器比较普遍，检测成本低，能及时准确的出具结果，是琼脂分散法检测效价的良好补充，或可取代琼脂扩散法进行效价的快速检测。