解淀粉芽孢杆菌Y11产淀粉的酶条件优化

聂晶晶，叶建斌，马 科，周留柱，杨雪鹏

（郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州 450001）

淀粉是烟草生长过程中积累的重要碳水化合物，广泛存在于烟草的茎叶中[1]，淀粉在烟叶细胞中的合成、积累、分解、转化状况，决定着烤后叶片内部各种化学成分之间的协调程度，影响着烟叶品质[2]。淀粉含量过高会影响燃烧速度和燃烧的完全性，产生焦煳气味，对烟气产生不良影响[3]。然而，淀粉经降解可转化为小分子碳水化合物，对烟气有积极作用，并且促进香味物质的生成，可改善抽吸品质[4]。目前，我国调制后烟叶淀粉含量偏高，是制约我国烟支品质的重要因素[5]。据了解，国内主要通过烟草育种、栽培、调制和醇化等方面来改善烟叶品质[6]。新鲜烟叶淀粉含量达到40%左右，经过卷烟加工，优质烤烟烟叶淀粉含量为1%～2%，但是对于等级较低的烟叶，经过卷烟加工后，淀粉含量依然偏高。大量研究表明，烟叶淀粉的大量降解主要是在烟叶初烤、复烤和烟叶陈化过程中，其中微生物的降解发挥着重要的作用[7]。但是烟叶中存在的微生物是有限的，依据烟叶中存在的微生物，很难使烟叶中淀粉降解到优质烤烟的要求[7]。

因此，现在利用外加酶及微生物来降解烟叶淀粉成为烟草行业研究的热点。试验以前期从烟叶表面筛选出的降解淀粉的解淀粉芽孢杆菌Y11为研究对象，对其产酶条件进行优化，以淀粉酶酶活为响应值，最终得到其最佳培养基成分及发酵条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌株，由前期试验，从烟叶中筛选出1株可以高效降解淀粉的菌株，通过形态观察、生理生化试验和分子鉴定等手段，鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌；葡萄糖、可溶性淀粉、玉米粉、蔗糖，以及（NH4）2SO4，MgSO4，CaCl2，FeSO4，K2PO4，天津市凯通化学试剂有限公司提供；酵母膏、蛋白胨、尿素等，北京奥博星生物技术责任公司提供；DNS试剂：称取5 g的3,5-二硝基水杨酸，边搅拌边加入到300 mL的去离子水中，缓慢加入5 g NaOH，在50℃水浴锅中水浴加热、搅拌溶解，然后加入100 g酒石酸钾钠，1 g苯酚和2.5 g的无水亚硫酸钠，搅拌溶解澄清后冷却至室温、用水定容至500 mL，贮藏在棕色试剂瓶中，在黑暗处放置1周以上使用。

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1.2 试验方法

1.2.1 培养方法

种子培养：挑取菌株单菌落接种到50 mL种子培养液中，培养至OD值为2.0～2.5，得种子液，将种子液放置4℃冰箱中备用。

初始培养基：葡萄糖10 g，蛋白胨5.0 g，酵母膏5.0 g，氯化钠10.0 g，1 000 mL，于121℃，20 min条件下灭菌。

发酵培养：取种子液1 mL接种于100 mL发酵培养基中，在37℃，200 r/min条件下发酵培养40 h。

1.2.2 淀粉酶活的测定方法

将发酵液高速离心（4℃，10 000 r/min，10 min），液体即为粗酶液。取1 mL粗酶液，加入到1 mL，5 g/L的可溶性淀粉溶液中，酶解时间20 min，加0.5 mol/L盐酸溶液1 mL混合均匀，加3 mL DNS试剂，沸水处理反应5 min，然后稀释到25 mL，测吸光度，计算酶活。对照为灭活的酶液，按照上诉操作。定义1 h酶解淀粉产生1 mg葡糖糖的酶量为一个酶活为1 U，单位为U/mL。

酶活=葡糖糖含量×N（60/n）.

式中：n——酶解时间；

N——粗酶液稀释倍数。

1.2.3 葡萄糖标准曲线的绘制

精确称取葡萄糖0.10 g，溶解到蒸馏水中，加水定容至100 mL，将溶液配置为质量浓度1.00 g/L的葡萄糖溶液，分别取0，2，4，6，8，10标准溶液定容至50 mL容量瓶中，即为质量浓度0，0.04，0.08，0.12，0.16，0.20， 0.24 g/L的标准溶液，分别取2 mL加入3 mL DNS，沸水浴反应5 min，冷却后，以去离子水做空白对照校正，用紫外分光光度计于波长550 nm处测吸光度A。

1.2.4 菌株的培养基成分的优化

（1）碳源试验。在初始培养基的基础上，氮源为蛋白胨10 g/L，酵母5 g/L，无机盐为NaCl 5 g/L，分别以10 g/L玉米粉、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖为碳源，酶活为响应值，得出最佳碳源，再考查最佳碳源量对酶活的影响，分别取最佳碳源量5，10，15，20，25 g/L，于37℃，200 r/min条件下发酵培养40 h，测产生淀粉酶活性。

（2）氮源试验。在初始培养基的基础上，以淀粉质量浓度为15 g/L，分别以10 g/L蛋白胨、（NH4）2SO4、酵母膏、尿素为氮源，测定酶活性，再对最佳氮源的添加量进行优化，其质量浓度分别为5，10，15，20，25 g/L，发酵条件及测定方法同上。

（3）无机盐试验。在初始培养基的基础上，碳源为可溶性淀粉15 g/L，氮源为酵母膏15 g/L，分别以 0.3 g/L K2HPO4，CaCL2，MgSO4，FeSO4作为无机盐，再对最佳无机盐的添加量进行优化，其质量浓度为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 g/L，发酵条件及测定方法同上。

1.2.5 响应面分析试验

采用Design Expert 8.0.6.1软件对培养基成分分析进行Box-Behnken响应面设计，在单因素试验的基础上，对碳源（淀粉）、氮源（酵母膏）、无机盐（MgSO4）三因素各设计3个水平。

Box-Behnken试验设计因素水平见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素水平/g·L-1

1.2.6 发酵培养条件优化

（1） 培养温度的优化。在最佳培养基的基础上，分别在20，25，30，35，40℃下，在转速200 r/min，pH值7，接种量1%条件下，培养40 h后，测定淀粉酶活性，考查温度对酶活的影响。

（2）pH值的优化。设置pH值5.0，6.0，7.0，8.0，在培养温度35℃，转速200 r/min，接种量1%条件下，培养40 h后，测定淀粉酶活性，考查pH值对酶活的影响。

（3）接种量的优化。设置接种量0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，在pH值7.0，培养温度35℃，在转速200 r/min，培养40 h条件下，测定淀粉酶活性，考查不同接种量对酶活的影响。

（4）正交试验。在单因素水平的基础上，再对温度、接种量、pH值3个因素进行正交试验设计，各设置3个不同的水平，进一步确定菌株产酶的最优条件，采用L9（34）正交表进行试验。

正交试验因素与水平设计见表2。

表2 正交试验因素与水平设计

1.3 数据分析

数据均用3次平行试验的平均值表示，响应面分析试验应用Design Expert软件中的RSREG（Response Surface Regression）程序进行响应面回归计算，并对回归方程进行方差分析和系数显著性检验。正交试验采用SPSS 17.0分析软件，对正交数据进行极差及方差分析。试验数据采用Origin 9.1作图。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线绘制

按照DNS方法测定

葡萄糖的标准曲线见图1。

图1 葡萄糖的标准曲线

根据标准曲线可知，吸光度与葡萄糖质量浓度的回归方程为Y=1.785 89X-0.011 54，相关系数R2=0.997 91，表明在0～0.3 g/L质量浓度范围内，葡萄糖质量浓度与吸光度A线性关系良好。

2.2 初始发酵条件下菌株产酶动力学

菌株的发酵曲线见图2。

图2 菌株的发酵曲线

由图2可知，菌体浓度及菌株产酶能力均随着发酵时间先增大后减少，且二者呈现极显著关系，菌株在发酵40 h时，产生淀粉酶达到最大；发酵时间大于40 h后，产淀粉酶酶活性下降，因此选择40 h为最佳发酵产酶时间，进行培养基成分及培养条件的优化。

2.3 培养基成分优化

2.3.1 碳源单因素试验

培养基中的碳源是构成菌体细胞和代谢产物的主要元素，又为微生物生命活动提供能量。同时还能作为菌株产生淀粉酶的诱导底物。选用淀粉、葡萄糖、蔗糖、玉米粉作为碳源进行优化，并对最佳碳源的量进行优化。

不同碳源对酶活的影响见图3，淀粉质量浓度对酶活的影响见图4。

图3 不同碳源对酶活的影响

图4 淀粉质量浓度对酶活的影响

由图3可知，淀粉作为碳源时，酶活最高，这可能是因为淀粉酶在有淀粉诱导下更有利于淀粉酶的产生，因此选择淀粉作为碳源。由图4可知，淀粉量为15 g/L时，酶活最高。

2.3.2 氮源单因素试验

氮源是组成菌体细胞和代谢产物的必需营养物质，培养基中使用的氮源一般分为无机和有机2种氮源。选择尿素、蛋白胨、酵母膏及硫酸铵为碳源，考查其对酶活的影响。

不同氮源对酶活的影响见图5，酵母膏质量浓度对酶活的影响见图6。

图5 不同氮源对酶活的影响

图6 酵母膏质量浓度对酶活的影响

由图5可知，酵母膏作为氮源，酶活性最高，而无机氮NH4SO4作为氮源时，酶活性最低，说明无机氮源不利于该菌株产生淀粉酶。因此，选择酵母膏作为最佳氮源，再对其质量浓度进行优化。由图6可知，酵母添加量在一定范围内可促进淀粉酶的产生，超出这一范围会不利于菌株的产酶，酵母膏质量浓度为15 g/L时，酶活最高。

2.3.3 无机盐单因素试验

无机盐在细胞中的含量虽然不多，但是生命活动所必需的，其主要功能是参与构成菌体成分，作为酶的组成部分，维持酶的活性或调解渗透压等。无机盐含量不足或者过高时，菌株生长都会受到抑制，导致产酶能力下降。

不同无机盐对酶活的影响见图7，硫酸镁质量浓度对酶活的影响见图8。

图7 不同无机盐对酶活的影响

图8 硫酸镁质量浓度对酶活的影响

由图6可知，MgSO4作为无机盐时酶活性最高，图7是MgSO4质量浓度的优化。由图7可知，MgSO4质量浓度为0.4 g/L时，酶活最高。

2.3.4 响应面分析试验

响应面试验设计与结果见表3，回归模型方差分析见表4。

表3 响应面试验设计与结果

表4 回归模型方差分析

利用Design Expert软件，对表3数据结果进行方差分析和模型的显著性分析，结果见表4。对响应面试验的响应值进行多元二次回归拟合，得到回归模型方程为：

由表4可知，该模型p=0.000 1＜0.010 0，说明回归模型可信度高。通过R2来判断该模型的拟合度，R2=0.970 8，表明有97.08%的试验数据可用此模型进行解释，进一步说明回归方程的拟合程度较好。

该模型的拟合度回归方程各项方差分析表明，一次项A（淀粉）、B（酵母膏）对酶活影响是非常显著的，C（MgSO4）对其酶活影响不显著，二次项A2，B2，C2的影响是极显著，但其交互作用AB，AC，BC是不显著的，说明各具体试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系；由F值判断，在选择范围内，3个因素对淀粉酶活的影响顺序为A>B>C。

2.3.5 响应曲面图分析各因素交互作用对酶活影响的响应曲面图见图9。通过Design Expert软件对3个试验因素分别两两交互，做出响应曲面图。由图9可知，淀粉与MgSO4对酶活的交互作用最强，其次是酵母膏与MgSO4，而淀粉与MgSO4的交互作用最弱。同时影响酶活最显著的因素是淀粉，表现为其响应面弧度变化最大，其次是酵母膏和MgSO4。

应用Design Expert软件得到培养基的最佳配方为淀粉质量浓度16.29 g/L，酵母膏质量浓度16.04 g/L，MgSO4质量浓度0.42 g/L，此时酶活为60.069 6 U/mL，并对其进行3次试验验证，得到酶活为60.11 U/mL，与理论值基本吻合，说明该回归方程能比较真实地反映各因素对产生酶活的影响。

图9 各因素交互作用对酶活影响的响应曲面图

2.3.6 培养条件优化结果

（1）培养温度优化的结果。

培养温度对酶活的影响见图10。

图10 培养温度对酶活的影响

微生物在不同的生长温度下，生长速率不同，在适合的温度下微生物生长周期缩短，产酶量增多，因此找到微生物的最适产酶温度，对于提高酶活性具有重要的意义[8]。由图10可知，在温度20～35℃，随着温度的上升，酶活性逐渐提高；到达35℃后，随着温度的上升，酶活性开始下降，因此解淀粉芽孢杆菌Y11的最佳发酵温度是35℃。

（2）培养pH值的优化结果。

初始pH值对酶活的影响见图11。

培养基的pH值会影响菌体的形态和代谢产物的合成途径，从而影响菌体的产酶能力。图11是初始pH值对酶活影响的结果，从图11中可以看出，该菌株的最佳发酵pH值为7.0。

（3）培养接种量的优化结果。

图11 初始pH值对酶活的影响

接种量对酶活的影响见图12。

图12 接种量对酶活的影响

由图12可以看出，接种量在0.5%～1.5%时，酶活性随着接种量的增加而增加，接种量为1.5%时，酶活性达到最大值，当接种量大于1.5%，酶活性随着接种量的增加而减少。因此，选择接种量为1.5%作为最佳接种量。

（4）正交试验优化结果。

正交试验设计与结果分析见表5，正交设计方差分析结果见表6。

采用正交试验对菌株的发酵温度、pH值、接种量进行优化，选出最佳组合。通过表6中p值可以看出，B'（pH值）、A'（温度）对酶活影响是显著的，而接种量在1%～2%的范围内对酶活影响是不显著的。由表5数据极差分析，可知因素主次顺序为B'>A'>C'。因素B'，即培养初始pH值对酶活影响最大，是极显著的；因素C'，即接种量对酶活的影响最小，得到最佳培养条件为即培养温度35℃，pH值7，接种量1.5%，经过3次平行试验得酶活为70.2 U/mL。

表5 正交试验设计与结果分析

表6 正交设计方差分析结果

3 结论

通过单因素试验、响应面试验及正交试验对解淀粉芽孢杆菌Y11液体发酵产生淀粉酶的培养基成分及发酵培养条件进行优化，得到最佳培养基成分为淀粉质量浓度16.29 g/L，酵母膏质量浓度16.04 g/L，MgSO4质量浓度0.42 g/L，最佳培养条件为培养温度35℃，pH值7，接种量1.5%，得到酶活为70.2 U/mL，初始培养条件下酶活25.2 U/mL，优化后酶活提高了1.8倍。试验的解淀粉芽孢杆菌Y11在经过条件优化后，产淀粉酶能力显著提升，在烟草本源微生物产淀粉酶能力中处于较高的产酶水平，对于微生物降解烟叶中的淀粉具有重要的意义。