福建省2008-2017年人间布鲁氏菌病流行特征及分离株MLVA分型研究

布鲁氏菌病(Brucellosis，简称布病)，是由布鲁氏菌属(Brucella，简称布氏菌)的细菌侵犯机体后引起的传染-变态反应性的人兽共患传染病。布氏菌主要存在于牛、羊、猪等家畜和野生动物中，人直接或间接接触被感染的动物及其制品后可被感染，若治疗不及时易转为难以治愈的慢性病人。布病遍及世界约170个国家和地区，已成为全球特别是发展中国家所面临的重要公共卫生问题之一[1]，我国每个省区的人畜中几乎都有不同程度的存在和流行[2]，严重危害人类健康、危及食品安全和阻碍畜牧业经济发展。20世纪90年代中期以来，我国布病疫情明显回升，尤其是2000年以后，布病疫情强势走高，报告发病例数平均每年增长10%[3]，近几年，福建省布病病例报告数增加，发病率呈逐年增高趋势，聚集性疫情时有发生[4]。本文分析2008-2017年福建省人间布病流行特征，并对布氏菌分离株进行基因分型，探讨菌株间内在联系，通过对布氏菌分离株进行分子流行病学研究，为制定布病预防控制策略提供科学依据。

1 材料与方法

1.1资料来源 2008-2017年人间布病疫情资料来自《中国疾病预防控制信息系统》中布病报告卡(已审核卡和临床与实验室诊断病例)；人口资料来自《中国疾病预防控制信息系统》福建省常住人口。

1.2菌株来源 40株疑似布氏菌分离自福建省2012-2018年期间布病现症病人血液标本，布氏菌标准参考菌株羊种(16M)、猪种(1330)和牛种(544)与疫苗菌株S2和M5均由本实验室保存。

1.3仪器与试剂 主要仪器有LabChip GX II Touch生物大分子分析仪(PerkinElmer公司)、DNA 5K/RNA/CZE LabChip芯片、CLASS II TYPEA2生物安全柜、CO2培养箱、梯度PCR仪、冷冻高速离心机、电泳仪、凝胶成像系统等；主要试剂有布氏菌培养基(BD产品)、细菌基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN产品)、EasyTaq PCR SuperMix(全式金产品)、HT DNA 5K Reagent Kit试剂盒、DL2000 DNA marker(Takara产品)等，所用试剂均在保质期内。引物合成与测序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.4传统生物学鉴定 根据菌落染色、形态、生长特性和布氏菌诊断血清凝集试验确定布氏菌，利用单项特异性A/M血清凝集试验(玻片凝集试验)、H2S产生试验、CO2需求、双层琼脂法噬菌体(TB和BK2)裂解(RTD)试验、染料硫堇/碱性复红抑菌试验等进行种/型鉴定，具体操作步骤参照文献[5]进行。

1.5菌株DNA制备 将分离菌株转种于布氏菌斜面培养基，37 ℃培养48 h，挑取适量对数生长期的布氏菌菌苔于300 μL无菌去离子水中混匀，80 ℃ 2 h灭活细菌后，按照细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明提取DNA， -20 ℃冻存备用。

1.6BCSP31-PCR和AMOS-PCR 根据BCSP31核苷酸序列设计的引物可以对布氏菌进行属的鉴定；AMOS-PCR可鉴定牛种布氏菌(1、2、4型)，羊种布氏菌(1、2、3型)，猪种布氏菌(1型)以及绵羊附睾种布氏菌。引物序列、扩增体系及反应条件参考文献[5-7]进行。

1.7MLVA-16(16位点可变数目串联重复序列分析) 这是一个基于PCR技术的分型方法，该方法通过区分基因组上多个具有多态性串联重复序列位点 (VNTR)的重复单元拷贝数的差异来区分菌株。16 个位点的16对引物分为2组：panel 1包括8个位点(Bruce06、Bruce08、Bruce11、Bruce12、Bruce 42、Bruce43、Bruce45和Bruce55), panel 2包括panel 2A的3个位点(Bruce18、Bruce19和Bruce21)和panel 2B的5个位点(Bruce04、Bruce07、Bruce09、Bruce16和 Bruce30)。引物序列、扩增体系及反应条件均参考文献[8-10]进行，每次扩增均以16M参考菌株作阳性对照。PCR产物严格按照LabChip GX II Touch生物大分子分析仪、DNA 5K/RNA/CZE LabChip芯片和HT DNA 5K Reagent Kit试剂盒操作步骤和使用说明来分析确定各位点扩增产物的大小[11]，同时结合测序结果，计算检测位点中各VNTR的重复单元数，将16个位点串联重复数值输入到 http://mlva.u-psud.fr/，与数据库进行比较，确定该菌株基因型别。获得所有菌株的重复序列个数后，利用BioNumerics 6.6软件对16个位点进行聚类分析。同时选取已发表文献中其他省份的布氏菌株的MLVA-16结果进行比较。

1.8统计方法 使用SPSS 24.0统计软件，结合描述性流行病学方法进行分析，P<0.05差异有统计学意义。根据PCR产物大小换算各位点重复单元数，结果录入 Excel数据库中，利用BioNumerics6.6软件进行聚类分析，选择平均连锁聚类法(unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA),将获得的分型与布氏菌数据库在线比较。

2 结 果

2.1疫情概况 福建省2008-2017年共报告布病416例，无死亡；年均报告发病率0.11/10万，发病率总体呈逐年上升趋势(趋势χ2=256.92，P<0.01)，图1。

图1 福建省2008-2017年人间布鲁氏菌病发病情况Fig.1 Annual incidences of brucellosis in Fujian Province during 2008-2017

2.1.1地区分布 福建省各设区市均有病例报告，总体呈散发态势。漳州(128例)、泉州(68例)和南平(67例)发病数居前3位，占病例报告总数的63.2%；报告发病率居前的设区市依次为漳州(0.26/10万)、南平(0.25/10万)和宁德(0.11/10万)，莆田最低(0.03/10万)。疫情累计波及全省70个县区(80%)，各年发病县区数分别为3、3、4、12、14、18、21、36、28和40个，呈增加趋势(趋势χ2=103.72，P<0.01)；以县(区)为单位，发病数前5位依次为邵武市(51例)、龙海市(44例)、南安市(27例)、芗城区(24例)和平和县(21例)，合计占全省病例的40.1%，报告发病率以邵武市最高(1.85/10万)，其次为龙文区(0.68/10万)和龙海市(0.48/10万)。

2.1.2时间分布 人间布病全年均有发生，发病高峰为4-8月，报告发病数为228例，占全年发病数的54.8%；发病数较多的月份为5月(55例，13.2%)、4月(46例，11.1%)，其次为6月和8月，均为44例，占比均为10.6%。冬季发病较少，其中11月份报告发病数较低，为17例。

2.1.3人群分布 416例病例中，男297例，女119例，发病率男女性别比为2.50∶1，分别为 0.15/10万和0.06/10万，差异有统计学意义(χ2=67.50，P<0.01)。发病年龄7个月至79岁，40～64岁合计占62.7%，其中发病数以45～49岁组最多66例(15.9%)，发病率以60～64岁组最高 (0.27/10万)。职业以农民(174例)、家务及待业(46例)和牧民(37例)为主，占比61.8%，其中农牧民为50.7%；商业服务、离退人员、工人等其他职业占比38.2%，其中学生和散居儿童为4.8%，职业不详和其他为21.2%。

2.2传统生物学鉴定 40株疑似布氏菌分离株在普通大气下即可生长，呈现圆形、湿润、稍隆起、表面光滑、无色透明的菌落形态和无色、透明、湿润的菌苔特点；布氏菌诊断血清凝集试验均为阳性；所有试验结果判定参照FAO/WHO布病专家委员会第6次公报公布的布氏菌属分类表(1985年)，分别鉴定为5株猪种3型布氏菌和35株羊种3型布氏菌，羊种菌占比87.5%。

2.3BCSP31-PCR鉴定 提取40株疑似布氏菌分离株、3株标准菌株和2株疫苗菌株核酸，用标准菌株和疫苗菌株作阳性对照，无菌水作阴性对照，进行BCSP31-PCR扩增，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶上电泳检测结果显示，所有布氏菌分离菌株和参考菌株均出现扩增目的片段长度为223 bp的特异性条带，扩增获得了预期片段，判定为布氏菌，而阴性对照未出现条带，图2。

M:DL2000 DNA Marker; 1～5：阳性对照，分别为羊种16M，牛种544，猪种1330，疫苗菌株S2和M5; 6：阴性对照; 7～46:为分离菌株图2 福建省布鲁氏菌分离株BCSP31-PCR鉴定结果Fig.2 BCSP31-PCR identification for Brucella isolates from Fujian Province

2.4AMOS-PCR鉴定结果 AMOS-PCR对40株布氏菌分离株，3株标准菌株和2株疫苗菌株核酸进行扩增，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶上电泳检测结果显示，所有阳性对照均出现特异性条带，扩增获得了预期片段，分别为羊种(16M和M5)731 bp、牛种(544)498 bp和猪种(1330和S2)285 bp，阴性对照未见扩增；布氏菌分离株中35株均扩增获得731 bp特异性条带，与羊种布氏菌(1、2、3型)扩增结果一致，判定为羊种布氏菌；其余5株布氏菌分离株均未出现条带，猪3型布氏菌未能鉴别出，图3。

M:DL2000 DNA Marker; 1～5：阳性对照，分别为羊种16M，牛种544，猪种1330，疫苗菌株S2和M5; 6：阴性对照; 7～46:为分离菌株图3 福建省布鲁氏菌分离株AMOS-PCR鉴定结果Fig.3 AMOS-PCR identification for Brucella isolates from Fujian Province

2.5MLVA-16分型 40株布氏菌分离株来自福建省9个设区市中的8个。所有分离株聚类成羊种菌(35株)和猪种菌(5株)2个种群，猪种菌均来自漳州地区。

panel 1用于确定布氏菌的种和地理信息。其结果显示，35株羊种菌分属于3种基因型：42型(1-5-3-13-2-2-3-2)29株(82.9%)，43型(1-5-3-13-3-2-3-2)4株，63型(1-5-3-13-2-3-3-2)2株，三种基因型均属于“东地中海型”(East Mediterranean group)；panel 2A结果显示均为基因41型(4-20-8)。5株猪种菌 panel 1显示均为基因4型(2-3-4-11-3-1-5-2)，panel 2A显示均为基因15型(4-19-9)。panel 2B则显示了较高的变异性。

综合16个位点扩增结果，MLVA-16显示40株布氏菌包含32种基因型，羊种菌、猪种菌分别含有28种和4种基因型，其中26种基因型为单分离株，6种基因型为共享基因型，分别由2-4株布氏菌分离株共享(共14株，35.0%)。6种共享基因型中01基因型(4株)分离自漳州和厦门，03基因型(2株)分离自三明和厦门，其他05(2株)、15(2株)、26(2株)和31(2株)共享基因型均分离自同一地区，其中漳州地区分离的羊种菌和猪种菌中均有共享基因型，图4。

同国内已发表文献[9-10,12]中的147株布氏菌(羊种菌105株、猪种菌26株和牛种菌16株)MLVA-16分型结果进行聚类分析，福建省5株羊种菌与外省菌株存在4种共享基因型，其中3株与内蒙古地区羊种菌共享3种基因型，2株与广东羊种菌共享1种基因型。其他部分菌株与外省菌株存在着较近的遗传距离，主要表现在panel 2B有1-3个位点的差异，图5。

3 讨 论

目前，我国布病疫情正处于历史上较为严重的时期，布病病例主要集中在北方地区，南方地区以散发病例为主，但暴发疫情仍时有发生[4,13]。福建省近几年畜牧业快速发展，从省外引进家畜较多，地区间牲畜及其制品交易和流通日益频繁，由于检疫监管制度不健全和布病动物扑杀制度难以执行，导致检疫无保障，许多未经检疫和患病的牲畜及其制品频繁流通于市场中，加之群众缺乏布病防治知识，为布病的输入和疫情高发埋下了隐患。自2008年起，福建省布病流行强度呈逐年增高态势，疫情从局部高发地区逐渐向相邻低发或无疫情地区快速扩散，累计波及全省70个县区，病例呈逐年增加趋势，并由职业人群向一般人群蔓延。福建省布病发病呈高度散发状态的同时又呈现一定地域性，多分布于漳州和南平地区，可能与其羊、猪等家畜饲养及其制品加工业较发达有关。因此，重点控制布病疫情高发区的同时，也要做好相邻低发区的布病防控，必要时应严格限制活畜从高风险地区向低风险地区流动，防止疫情的快速蔓延与扩散。

图4 福建省布鲁氏菌分离株MLVA-16聚类分析树状图Fig.4 Dendrogram based on the MLVA-16 genotyping assay(UPGMA method), showing relationships of the 40 Brucella isolates from Fujian Province

图5 福建省布氏菌分离株MLVA-16基因型聚类分析MST图Fig.5 Clustering analysis (minimum spanning tree for categorical data) based on MLVA-16 genotype data, showing relationships between the 40 Brucella isolates from Fujian Province and 147 other strains from different regions in China

福建省布病全年均有病例报告，发病高峰期在4-8月，其季节性变化与羊种布氏菌人间发病高峰一致，与羊群产羔及流产季节密切相关[13]，结合分离菌株羊种占比高达87.5%，说明福建省流行的优势布氏菌种为羊种布氏菌。福建省近几年男性布病发病率高于女性，男女性别感染布病的区别可能取决于男性从事畜牧业生产及屠宰等活动较多，与病畜接触机会较高导致，但没有性别敏感性差异[13]。任何年龄组人群对布氏菌皆易感，发病年龄以40～64岁为主，同样是取决于病畜接触机会[14]，因为青壮年作为主要劳动力，与病畜接触频繁而导致其感染机会增高。福建省布病发病仍然以农牧民等职业人群为主，但近几年已经呈现家务及待业、离退人员、商业服务、学生等非职业性感染增多的趋势，说明目前布氏菌的感染因素和途径更加复杂化，菌株毒力较强，偶然接触即可被感染。

本研究选用的3种基于PCR技术的布氏菌分子鉴定与分型方法(BCSP31-PCR、AMOS-PCR和MLVA-16)，基本可以完成国内主要引起人感染的流行菌种(型)鉴定，可以用来弥补传统布氏菌种型鉴定中的不足[15]。通过对40株福建省布氏菌分离株的检测结果也与传统分型基本一致，两者综合显示福建省的布氏菌为2个种(羊种和猪种)和2个生物型(羊3型和猪3型)，其中羊种布氏菌占绝大多数(87.5%)，以羊3型为福建省当前主要流行菌型，提示福建省控制人间布病疫情应重点控制羊的布病疫情。此外，本次研究中分离的人间布氏菌株并未发现牛种等布氏菌，本省是否存在其它种布氏菌有待于今后分离更多的人/畜间布氏菌株进行验证。

目前，国际上通用的基于16个位点的布氏菌MLVA分型方法(MLVA-16)，具有快速、操作简单、重复性好等优点，不涉及大量活菌操作，极大地降低了实验室感染机率，且结果转化为字符数据类型，便于实验室间的比较和保存，已在分子流行病学、区分基因型、种群结构和菌株间亲缘进化关系等方面得到广泛应用，可以作为传统表型鉴定方法的补充，为布病流行病学溯源提供更多的分子生物学证据。40株布氏菌分离株分别聚类成羊种和猪种2个种群，35株羊种菌在panel 1的8个位点分别为基因42、43和63型，均属于“东地中海型”(East Mediterranean group)，其中基因42型在省内分布广泛，同国内其他地区研究结果一致[9]。Panel 2中的panel 2B的5个位点变异度较高，对分析菌株基因多态性和相同生物型菌株间的变异更有价值，可将35株羊种菌分为28个基因型，5株猪种菌分为4个基因型，表明福建省目前流行的布氏菌存在着丰富的基因多态性。

聚类分析结果显示，福建省分离的部分菌株间存在共享基因型，漳州、南平、宁德和龙岩地区分离的部分菌株基因型分别一致，提示上述地区近几年存在着布病聚集性疫情的可能，与我省近几年报告的布病聚集性疫情事件基本一致[4]。厦门与漳州、三明地区分离的部分菌株分别出现共享基因型，提示市场中染疫动物及其制品的跨区域传播未得到有效控制，农牧部门应加强畜间疫情监测和布病防控措施的落实。不同时间于不同地区分离得到的布氏菌基因型一致，是因为该基因型长期存在于某一地区的动物中，发生了跨区域运输与交易引起交叉感染，还是因为购自于同一地区的患病动物及其制品引起，则需要结合当地畜间布氏菌分子流行病学进行相互验证，这方面有待于进一步研究。同时，26个分离株表现出不同的基因型，显示流行病学无关的散发特征，提示福建省目前布病疫情仍然以散发为主。值得强调的是，虽然羊种布氏菌为福建省乃至全国当前主要流行菌型，但作为福建省布病疫情较为严重的漳州地区，时常发生由猪种布氏菌引起该地区人间布病聚集性疫情[4]，可能与该地区近几年养猪业快速发展，从事养猪、屠宰加工的布病高危人群快速增加，同周边地区或省外牲畜交易和流动活跃等有关；并且猪种布氏菌对人致病性更普遍[10]，因此在做好羊种布病防控的同时，漳州地区亦要加强猪种布病的防控，做好病猪的扑杀补偿制度，防止传染源转移造成疫情的蔓延。

此外，部分发病时间相近或发病地区相近的同一种型的菌株往往分别聚在一起，显示出基因型高度相似性，说明在这一年或近几年同一地区或相近地区流行菌株基因型相同或相近，分别存在着优势基因型[12,16-17]。结合菌株分离时间、地区和患者发病时间等详细流行病学资料，聚类在同一基因型别的簇中的这些菌株可能存在共同感染来源(同一群羊或同一群猪)，提示预警信息，可用于发现布病疫情暴发关联，查找危险因素，示踪传播途径，进而追溯传染来源[17]。

既往研究证实，MLVA-16基因分型结果与流行病学资料有较好的相关性，流行病学相关的分离株显示相同或非常相似的基因型[18-19]。MLVA-16分型在布病疫情暴发中流行病学关联的识别和反向追踪调查方面，可以作为一个非常实用和重要的分子基因分型工具。通过与国内其他省份布鲁氏菌MLVA-16分型结果的聚类分析，显示福建省与其他省部分菌株存在着高度同源性，如与内蒙古和广东省菌株甚至出现MLVA-16基因型别一致的现象，其他部分菌株仅在panel 2B出现1～3个位点的差异，提示福建省可能与其他各省之间存在着长期的地区间牲畜及其制品流通，在加强从布病主要流行病区牲畜及其制品进入检疫监管力度的同时，亦要防范周边布病非主要流行病区染疫动物的流入，若不能加强传染源的防控力度，势必会造成本地疫情暴发和外来输入性传播的内外双重风险的夹击，给布病防控带来极大的难度。

综上所述，针对福建省布病疫情和分子流行病学特征，建议：1)农牧部门应加强畜间布病监测(包括病原学监测)，增强畜间检疫及布病动物扑杀等措施落实，做到从源头防控布病动物的流通扩散；2)卫生部门应加强基层医务人员布病诊疗水平、医院实验室诊断能力和职业人群及密切接触人群的健康教育与行为干预，做到人间布病早发现、早诊断和早治疗；3)建立以政府为主导，多省市多部门协助的联防联控机制，定期相互通报人/畜间布病疫情；4)尽快建立适合于基层推广应用的布病诊断和布氏菌分型新方法，并应用于日常布氏菌监测和疫区的布病防治工作中，与传统布病防控方法相结合，做到真正意义上的早期预警和流行病学溯源，及时提示预警信息，追溯传染来源，有助于分析布病疫情及流行趋势，为防控策略的制定和实施提供科学依据。

利益冲突：无

引用本文格式：韩腾伟,林代华,刘菁,等.福建省2008-2017年人间布鲁氏菌病流行特征及分离株MLVA分型研究[J].中国人兽共患病学报,2019,35(5):382-388.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.059