布氏菌与巨噬细胞的相互作用机制

高 微,郑 培,陈 莹,王 策,袁丽云,曹志然

布氏菌与巨噬细胞的相互作用机制

高 微,郑 培,陈 莹,王 策,袁丽云,曹志然

布氏菌病是由布氏菌感染引起的、严重的人兽共患传染病。病原是一种革兰氏阴性、兼性胞内寄生菌。巨噬细胞既是重要的固有免疫应答细胞同时又是布氏菌感染的重要靶细胞，布氏菌进入宿主后在一系列毒力因子的帮助下侵入宿主的巨噬细胞中，并通过多种机制抵抗巨噬细胞的杀菌作用，有利于其在巨噬细胞内生存和繁殖；同时巨噬细胞也可通过一系列机制抵抗布氏菌的感染。通过研究布氏菌与巨噬细胞的相互作用机制对于布氏菌病的防治具有重要的指导意义。

布氏菌；巨噬细胞；机制；毒力因子；细胞因子

布氏菌是革兰氏阴性兼性胞内寄生菌，它引起的布氏菌病是一种重要的人畜共患传染病，布氏菌可通过消化道、呼吸道、泌尿生殖道和皮肤等多种途径进入体内，临床主要表现为波浪热、关节炎、脊柱损伤、神经系统损伤、心内膜炎、睾丸炎和附睾炎等多器官损伤，还可能引起孕妇或怀孕动物的流产。该病在全球有着广泛的流行区域，尤其是在发展中国家，已成为严重危害人类健康的重要传染病之一。据卫生部发布的信息，2013年感染人数为43 486例，比2012年(39 515例)增加10%，位居37种报告传染病的第13位，因此给人类的经济生活和身心健康带来了巨大的影响。但是目前尚无安全有效的疫苗用于本病的预防，而适合人类应用的新疫苗的研制有赖于布氏菌与宿主作用机制的深入研究。巨噬细胞既是重要的免疫细胞又是布氏菌感染的主要靶细胞，因此布氏菌与巨噬细胞相互作用的机制是广大研究者研究的重要课题，本文综述了布氏菌与巨噬细胞相互作用机制研究进展。

1 布氏菌抵抗巨噬细胞杀伤作用机制

布氏菌不存在典型的毒力因子如溶细胞素、外毒素分泌蛋白、菌毛等，其能侵入巨噬细胞并且逃脱巨噬细胞的杀伤作用而在其中繁殖，胞内环境为布氏菌的生长繁殖提供了一个安全的空间，以防止在感染过程中产生的抗体和补体的作用[1]。巨噬细胞在机体固有免疫应答中占据很重要的位置，它既可以提呈抗原启动适应性免疫应答，又可以非特异性吞噬杀伤多种病原微生物，而这些作用都不能阻止布氏菌在其中的繁殖，主要原因有以下几点：①布氏菌抑制吞噬内体与溶酶体融合；②布氏菌适应巨噬细胞内恶劣环境；③布氏菌可抑制巨噬细胞活化及分泌细胞因子；④布氏菌抑制巨噬细胞抗原提呈；⑤抑制巨噬细胞凋亡。这些都需要布氏菌与巨噬细胞的相互作用。

1.1 布氏菌可抑制吞噬小体和溶酶体融合 细菌进入巨噬细胞后可形成吞噬小体，吞噬小体与胞内的溶酶体融合形成的吞噬溶酶体可以将细菌分解从而杀死细菌。然而研究表明光滑型布氏菌感染后，它的LPS O-链抑制吞噬小体与巨噬细胞溶酶体的早期融合，因粗糙型布氏菌不能表达O抗原，所以迅速与溶酶体融合，导致布氏菌降解[2]。因此布氏菌的LPS O-链抑制吞噬溶酶体的形成以保护它不被溶酶体酶降解。

此外布氏菌小体(BCVs)的成熟涉及到与细胞质中的内质网持续相互作用并融合，此过程导致一个允许细菌复制的空泡产生，Porte等的研究表明一个virBⅣ型分泌系统的布氏菌突变体不能与内质网相互作用，并且会通过与溶酶体融合而被杀死，据此说明Ⅳ型分泌系统通过参与BCVs成熟抑制吞噬溶酶体形成[3]。

1.2 布氏菌可适应巨噬细胞内恶劣环境 布氏菌进入巨噬细胞后面临各种恶劣环境，包括营养缺乏、低pH、氧化环境，长期在巨噬细胞中存活的布氏菌可以表达各种基因产物来适应胞内恶劣环境[4]。

1.2.1 抵抗营养不足 细菌的胞内生存都需要营养支持，然而布氏菌进入巨噬细胞后形成吞噬体，在吞噬体中表现出明显的营养不足，所以布氏菌株阻断糖酵解途径，利用磷酸戊糖途径和三羧酸循环作为能量来源[5]。营养不足主要表现为氧气缺乏，氧气作为电子终端受体为布氏菌的呼吸代谢提供燃料。研究表明布氏菌可以产生cbb3型细胞色素C氧化酶和细胞色素bd泛醇氧化酶复合物，它允许NO3-代替O2作为电子终端受体参与呼吸代谢，使细菌在低O2浓度下有效呼吸。所以布氏菌可以抵抗低氧的营养不足环境，在巨噬细胞内复制和繁殖[6]。

1.2.2 抗氧化损害 布氏菌在有氧呼吸过程中产生活性氧(ROS)如O2-和H2O2代谢产物，由于O2-为带电分子所以不能通过细菌细胞膜，所以会抑制布氏菌的生长繁殖，但研究表明布氏菌可以产生应激蛋白超氧化物歧化酶(SOD)来抵抗活性氧代谢产物的损害，使布氏菌能在胞内生存[7]。

1.2.3 耐受酸性环境 酸性环境可以抑制细菌的生长繁殖，然而布氏菌却可以通过产生各种基因产物耐受它所遇到的酸性环境从而在胞内生长繁殖。hdeA是布氏菌周质中的分子伴侣，Valderas的研究表明，一个布氏菌hdeA突变株对酸性环境的抵抗能力比野生菌株弱，由此证明hdeA在布氏菌抵抗酸性环境中起到重要作用。布氏菌2308株也可以通过产生基因产物Asp24结合蛋白耐受它所遇到的酸性环境[8]，使其顺利在胞内复制繁殖。

1.3 布氏菌可抑制巨噬细胞活化及分泌细胞因子 巨噬细胞可通过产生TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12等多种细胞因子来发挥抗感染作用。但布氏菌感染巨噬细胞后却抑制TNF-α、IL-1β和IL-6等细胞因子的产生。Jubier-Maurin 等人研究了野生型B.suis1330的主要外膜蛋白(Omp25和Omp31)对细胞因子产生的影响，结果表明B.suis的Omp25对巨噬细胞产生TNF-α起负调控作用[9]。

布氏菌的LPS也抑制细胞因子的分泌，研究表明布氏菌的内膜蛋白bacA影响LPS的结构，Parent等用bacA基因敲除的布氏菌突变株KL7感染BALB/c小鼠腹腔，结果巨噬细胞产生大量细胞因子抵抗KL7的感染，相反野生型布氏菌2308感染C57BL/6小鼠却不能诱导细胞因子分泌，结果表明布氏菌的LPS可以抑制巨噬细胞活化及细胞因子分泌[10]。

1.4 布氏菌可抑制抗原提呈 外源性细菌侵入宿主后，巨噬细胞可以通过吞噬细菌来摄取抗原，并加工处理形成抗原肽-MHC-II复合物，呈递给CD4+T细胞启动适应性免疫应答来抵抗细菌感染。但布氏菌进入巨噬细胞后通过一系列机制抑制其抗原提呈能力，因此减弱T细胞介导的免疫应答[11]。研究表明布氏菌LPS虽然不能抑制MHC-II类分子表达，但可在空间上干扰MΦ的MHC-II类分子，抑制其抗原提呈[12]。Barrionuevo等体外培养B.abortusS2308和B.ovisREO 198后感染小鼠腹腔，实验证明布氏菌脂蛋白L-Omp19可通过TLR2和IL-6抑制IFN-γ诱导MΦ表达MHC-Ⅱ分子及其抗原提呈，阻止抗原特异性T细胞对布氏菌的识别，逃避机体的免疫监视，从而导致慢性感染的形成[13]。

1.5 布氏菌可抑制巨噬细胞凋亡 外来细菌进入细胞后会诱导巨噬细胞凋亡，一方面细胞凋亡后胞内细菌释放到胞外环境中可被抗体、补体和各种抗生素捕获，从而杀死细菌；另一方面凋亡小体释放出的抗原成分可被树突状细胞(DC)识别使其活化并提呈抗原启动适应性免疫应答。但布氏菌感染巨噬细胞后能通过各种机制抑制其凋亡，使其能在胞内复制繁殖。

Cui 等的研究表明巨噬细胞凋亡需要钙依赖性蛋白酶2的参与，而布氏菌感染后会使钙蛋白酶2下调，从而抑制巨噬细胞凋亡[14]。Guo等用布氏菌16M株感染小鼠巨噬细胞可以引发自噬体的形成从而激活巨噬细胞的自噬途径，该途径能够抑制半胱天冬酶9(Caspase-9)凋亡通路，从而抑制巨噬细胞凋亡，使布氏菌利于在宿主细胞内存活[15]。

布氏菌抑制巨噬细胞凋亡的另一原因是特定的线粒体相关基因的下调作用，引起巨噬细胞大部分转录改变。首先线粒体是活性氧(ROS)产生的主要场所，ROS是各种需氧细胞在应对不同刺激时产生的代谢副产物，它在细胞凋亡早期可以起到信使作用，研究表明布氏菌感染诱发线粒体应力路径下调，导致ROS产生减少，从而抑制巨噬细胞凋亡早期信号转导。其次线粒体外膜通透性增加会促进一些凋亡因子如细胞色素C的释放，它可以激活下游的细胞凋亡路径，压敏电阻器阴离子通道蛋白(Vdac1)对增加线粒体外膜通透性起重要作用，He 等的实验证明布氏菌感染后Vdac1减少，从而抑制巨噬细胞凋亡。综上所述，布氏菌感染早期引发巨噬细胞大部分转录改变，阻断细胞色素C的释放和线粒体活性氧的产生，防止细胞凋亡蛋白的级联反应激活，从而抑制巨噬细胞的凋亡[16]。

2 巨噬细胞抵抗布氏菌感染机制

即使布氏菌用很多策略试图为它的复制创造一个合适的环境，宿主细胞仍然通过各种直接或间接途径来识别和应答布氏菌。机体固有免疫系统是抵抗布氏菌感染的第一道防线，致敏的CD4+T细胞分泌很多细胞因子包括IFN-γ、趋化因子等来激活巨噬细胞的抗菌活性[17]，MyD88依赖的树突状细胞成熟和细胞因子的产生对控制布氏菌感染也起作用[18]。

2.1 巨噬细胞作为固有免疫细胞发挥抗布氏菌感染作用 宿主固有免疫信号在布氏菌感染过程中起到了至关重要的作用，是抵御病原体的第一道防线，其中的巨噬细胞是布氏菌感染的主要靶细胞。固有免疫细胞通过抗原识别受体感受病原相关模式分子信号，并通过产生细胞因子和抗菌中间产物来对病原体快速应答，一个病原相关模式分子与一个特定的模式识别受体相互作用启动信号转导和转录因子激活，激活的细胞核转录因子易位导致炎症细胞因子Ⅰ型干扰素、趋化因子等表达[19-20]，从而启动抗感染过程。

常见的模式识别受体有Toll样受体(TLRs)、NOD样受体(NLRs)，TLRs参与细胞外或液泡的激活途径，诱导IL-1β和IL-18的前体形式表达，NLRs对胞质刺激产生应答[21]。在布氏菌感染过程中最主要的受体是TLRs，因为细胞信号是由TLRs激活开始的。TLR2受脂质外膜蛋白(L-Omp16和L-Omp19)激活，TLR4由布氏菌脂多糖和U-Omp16激活，TLR9由布氏菌DNA激活。Marco Tulio 等的研究表明TLRs通过MyD88和IRAK-4触发胞内信号激活，从而引起NF-κB和MAPKs激活并产生炎性细胞因子启动抗感染过程[22]。其他胞质受体如NLRC4、NLRP3等在识别布氏菌中也起到附加作用，这些受体被布氏菌激活使NF-κB激活导致细胞因子合成。综上所述，布氏菌可能激活数个固有受体使细胞内信号激活和细胞因子的产生达到顶峰，其中TLRs对控制布氏菌感染是必需的，而NLRs(如NOD1和NOD2)对清除布氏菌是非必需的[23]。

2.2 巨噬细胞可抗原提呈启动抗布氏菌适应性免疫应答 机体的抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC)包括巨噬细胞、树突状细胞(dentritic cell, DC)、B细胞，但Billard 的研究表明若机体内巨噬细胞被局部清除后，DC可以被更好的激活以捕获和提呈抗原[24]。DC虽然可以直接捕获布氏菌，但捕获后不能被有效激活，经研究DC可以捕获周围凋亡或分解破裂的细胞碎片而被激活，推测可能这些碎片中含有的布氏菌抗原成分被DC捕获，促使DC激活和成熟并提呈抗原启动适应性免疫应答[25]。Li 等的实验证明光滑型菌株S2308诱导DC坏死和凋亡，而RB51减毒活疫苗诱导半胱天冬酶2(Caspase-2)介导的DC成熟、细胞因子的产生和适应性免疫应答的启动[26]。

综上所述，布氏菌通过一系列毒力因子抵抗巨噬细胞的杀伤作用使其能在宿主体内复制繁殖，巨噬细胞通过启动各种固有免疫和适应性免疫应答来抵抗布氏菌的感染。研究布氏菌与巨噬细胞相互作用的机制，不仅可以阐明布氏菌的致病机制，还将为安全有效疫苗的研制提供新的思路。

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Cao Zhi-ran; Email: caozhiran@163.com

Interaction mechanisms betweenBrucellaand macrophages

GAO Wei,ZHENG Pei,CHEN Ying,WANG Ce,YUAN Li-yun,CAO Zhi-ran

(HebeiUniversity,Baoding071000,China)

The pathogen of brucellosis is a Gram-negative, facultative intracellular bacterium. Macrophages are not only the important cells of the innate immune response but also the main target cells ofBrucella. After entering into hosts,Brucellacan invade macrophages with the help of a series of virulence factors and resist the bactericidal effect of macrophages by many mechanisms, which is good forBrucellato survive and reproduce in macrophages. At the same time, macrophages also resist the infection ofBrucellathrough a series of mechanisms. Researching the interaction mechanisms betweenBrucellaand macrophages has important guiding meaning to the prevention and treatment of brucellosis.

Brucella; macrophage; mechanism; virulence factor; cytokines

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.018

河北省自然科学基金项目(No.C2010000243)和河北大学国家级大学生创新训练计划项目(No.201410075028)联合资助

曹志然，Emial:caozhiran@163.com

河北大学基础医学院，保定 071000

Funded by the Natural Science Foundation of Hebei Province (No. C2010000243)

R378

A

1002-2694(2015)08-0771-04

2014-11-05；

2015-03-16