三种不同他汀类药物对去卵巢诱导骨质疏松大鼠骨密度的影响

龚海虹 林志航 林志强

福建省泉州市第一医院药剂科，福建 泉州 362000

骨质疏松症是一种常见的健康问题，其特征在于低骨量和骨结构退变，导致骨脆性增加和易于发生骨折[1]。女性比男性更容易发生骨质疏松症。与绝经前女性相比，绝经后的女性更易患上这种系统性骨骼疾病，并伴有更高的并发骨折的风险[2]。具有降脂作用的他汀类药物经常用于心血管疾病，有研究[3-4]表明它们可以增强骨祖细胞向成骨细胞分化，下调成骨细胞的凋亡，并上调骨形成蛋白-2(BMP-2)的表达，有助于骨再生。进一步研究[5]发现他汀类药物可以通过促进骨形成和抑制骨重吸收双重作用模式来促进成骨。阿托伐他汀、辛伐他汀和洛伐他汀是最常见的他汀类药物，多数研究[6-7]评估了他汀类药物对骨密度的有益作用，但是三种药物谁的效果更佳，目前尚未有研究报道。本研究将全面比较阿托伐他汀、辛伐他汀和洛伐他汀对去卵巢诱导的骨质疏松大鼠的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物和实验设计

30只12周龄成年雌性Sprague-Dawley大鼠(220～250 g/只)用于本研究。在整个实验期间，动物可随意获得标准饲料颗粒和水。通过肌内注射(50 mg / kg)盐酸氯胺酮(10%氯胺酮，Alfasan Co.，Woerden，荷兰)进行去卵巢手术(OVX，n=25)和假手术(Sham，n=5)。剃去双侧背部区域的毛发后，借助直手术镊子通过2 mm切口暴露卵巢。行血管结扎后，用手术剪将卵巢切除，并将其他暴露的组织重新放回原来位置。使用3.0丝线以常规方式缝合肌肉和皮肤的切口。通过皮下注射美洛昔康和头孢唑林钠(剂量1 mg/kg，每天1次)进行术后镇痛和抗感染治疗。在手术后12周，来自正常大鼠和去卵巢组的各5只动物被安乐死，并对它们的骨组织进行双能X线检测以确定骨质疏松症的形成。随后将剩下的大鼠分为四组即对照组(CON)、阿托伐他汀组(ATR)、辛伐他汀组(SIM)和洛伐他汀组(LOV)；分别给予生理盐水、阿托伐他汀 [25 mg(kg·d)]、辛伐他汀[25 mg(kg·d)]和洛伐他汀[25 mg(kg·d)]治疗2个月，每组5只动物。治疗2个月后，在过量的异氟烷下处死大鼠，通过腹主动脉取血，离心获取血清及股骨进行检测。

1.2 Micro-CT检测

使用Scanco μCT 35扫描仪(Scanco，Wangen-Brütti-sellen，瑞士)，在扫描参数设定为电压70 kv，电流114μA下获取左侧股骨的微型计算机断层扫描图(Micro-CT)，持续800 ms。通过显微Micro-CT(每个切片的厚度=6 μm，体素大小=10 μm)评估远侧生长板下方1 mm处选择的3 mm厚的感兴趣的体积(VOI)。根据显微CT扫描结果评估骨体积分数(bone volume ratio, BV/TV)、骨密度(bone mineral density, BMD)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)、骨小梁数量(trabecular number, Tb.N)、骨小梁分离度(trabecular separation, Tb.Sp)。

1.3 血液生化分析

通过腹主动脉取血，离心获取血清进行生化指标分析，包括碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素、C端端肽 I型胶原(CTX)、OPG和RANKL。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(北京北方生物技术公司，北京，中国)测定血清ALP、骨钙素、CTX、OPG和RANKL浓度。

1.4 生物力学评估

Micro-CT 扫描后将样本取右侧股骨，将其置于MTS-858型生物力学实验机上，支点跨距17 mm，中点为加压点，加载速度为 2 mm/min，计算机记录载荷-位移曲线，从载荷-变形曲线计算极限载荷(N)，能量(J)和刚度(N / mm)。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 去卵巢手术对大鼠骨密度影响

来自Sham和OVX组的大鼠股骨干骺端的BMD为(231.12±30.32)mg/cm2和(182.23±27.98)mg/cm2。在定量分析中，来自Sham组的大鼠股骨干骺端的BMD比OVX大鼠的高28.7%。这些数据证实实验中OVX大鼠骨质疏松症模型的建立是成功的。

2.2 Micro-CT检测结果

治疗2个月后大鼠的股骨Mciro-CT扫描结果如图1 A所示，微观参数如图1B～图1F所示。与CON组相比，LOV、ATR和SIM组的股骨远端骨量和小梁厚度明显增加(P<0.05)；而CON组的小梁间距增加(P<0.05)，但在LOV、ATR和SIM组中均降低(P<0.05)。骨组织形态计量学参数显示，SIM对去卵巢大鼠股骨骨量和骨密度保护作用效果最佳。

2.3 各种治疗方案对去卵巢大鼠血清骨钙素、CTX、OPG和RANKL的影响

各种治疗方案对去卵巢大鼠血清骨钙素、CTX、OPG和RANKL的影响如表1所示，与CON组比较，LOV、ATR、SIM组的骨钙蛋白、CTX和RANKL被观察到显著增加(P<0.05);观察到LOV、ATR、SIM组OPG和OPG/RANKL比值与CON组比较，差异有统计学意义(P<0.05);SIM组的OPG和OPG/RANKL比值明显高于LOV、ATR、CON组(P<0.05)。

图1 治疗2个月后大鼠股骨干骺端Micro-CT扫描结果和微观参数Fig.1 Micro-CT scans and microscopic parameters of femoral metaphysis of rats after 2 months of treatment

组别骨钙素/(ng/mL)CTX/(ng/mL)OPG/(ng/mL)RANKL/(ng/mL)OPG/RANKLCON1765±3.4528.47±4.352.95±0.171.96±0.181.03±0.54LOV15.43±2.3*24.45±3.46*3.38±0.57*1.45±0.11*2.72±0.23*ATR13.22±2.64*#23.21±2.45*#4.45±0.17*#1.35±0.08*#3.48±0.33*#SIM11.43±1.94*#&20.34±2.94*#&5.16±0.34*#&1.18±0.04*#&4.87±0.34*#&

注：与CON组比较，*P<0.05；与LOV组比较，#P<0.05；与ATR组比较，&P<0.05。

2.4 生物力学性能

通过生物力学测试获得的数据见图2。SIM组具有最高的极限载荷、能量和刚度，与CON、LOV和ATR组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 不同治疗方案对四组大鼠股骨生物力学的影响 A：极限载荷; B:能量; C:刚度Fig.2 Effects of different treatment regimens on femur biomechanics of rats in the four groups

3 讨论

骨质疏松症被认为是老年人群最常见的疾病之一，必须考虑对这种疾病进行有效的治疗。心血管疾病也被认为是与年龄密切相关的疾病，可能与骨质疏松症有共同的生物学途径[8]。他汀类药物被广泛用于预防心血管疾病并具有其他治疗作用，包括对骨骼有积极的生物学作用[9]。去卵巢大鼠已被证实[10]是模拟绝经后人骨组织临床情况的最佳模型之一。在笔者的研究中，OVX诱导的骨质疏松症模型通过卵巢切除后3个月的骨密度检测得到证实。

关于他汀类药物在骨愈合应用中的许多问题，如最有效的他汀类药物、有益浓度和潜在的副作用仍未得到解答[11]。在此次研究中，笔者比较分析了阿托伐他汀、辛伐他汀和洛伐他汀这三种最常用的他汀类药物治疗骨质疏松症的效果。研究结果表明，和其他两种他汀类药物相比，辛伐他汀可以更好的提高大鼠股骨骨密度，增加股骨的生物力学性能。此外，辛伐他汀比阿托伐他汀和洛伐他汀明显提高了成骨标志的表达。辛伐他汀和洛伐他汀的应用导致血清CTX水平降低，表明这些治疗方案在改善骨质疏松症方面的效率。

2001年的一项调查[12]表明，他汀类药物可以以剂量依赖性方式影响骨转换。该调查介绍了一种关于他汀类药物对骨转换有效性的新观点，表明了低剂量他汀类药物可以通过增加破骨细胞的活性而导致骨转换为吸收。另一方面，这些药物的高剂量同样可以增加骨形成和再吸收，而BMD的净变化很小[12]。因此，在这项研究中，笔者使用高剂量的亲脂性他汀类药物来预防OVX动物的骨质疏松症。关于药代动力学，考虑到啮齿类动物的代谢进程比人类快8～10倍[13]，以前的文献认为10 mg / (kg·d)剂量的他汀类药物作用于大鼠,相当于人类使用剂量为70 mg /d。根据先前体内研究中报道的高于临床应用中的常规剂量的有益作用，选择20～25 mg/(kg·d)的他汀类药物(相当于人140 mg/d)作为大鼠的治疗剂量，应在未来的临床试验中针对人类患者的剂量进行调整。

与其它组相比，组织形态计量学和显微CT扫描分析显示辛伐他汀组的骨显微结构和骨量显著改善；而阿托伐他汀组改善不明显。以前的文献[14]表明，阿托伐他汀导致骨重塑减少，可导致各种标志物如骨保护素(OPN)、BMP-2和胶原蛋白1型的明显减少。与正常骨组织相比，阿托伐他汀治疗骨中胶原1型表达水平较低[14]。相反，阿托伐他汀会导致健康或血脂异常[15]大鼠胫骨近端BMP-2的高表达。虽然此项研究中Micro-CT检测结果显示应用辛伐他汀和洛伐他汀后与对照组比较骨质疏松症改善更为明显，但与经过洛伐他汀治疗的动物相比，这种改善在辛伐他汀治疗的动物身上表现的更多。以往的研究[16]表明，洛伐他汀与其他生物活性分子的组合可以通过协同有益作用显著改善BMD。在关于OVX大鼠骨折部位骨愈合的研究中发现，单次剂量的洛伐他汀可以提高骨痂强度；而向洛伐他汀添加生育三烯酚不仅可以提高生物力学性能，还可以增强愈合组织的矿化作用[17]。

总的来说，笔者的研究结果表明，辛伐他汀和洛伐他汀与阿托伐他汀治疗相比，改善OVX大鼠骨密度更为明显。 此外，基于对成骨标志物的评估，辛伐他汀可以积极促进骨形成。 总体而言，与其他治疗方案相比，辛伐他汀显示出对改善OVX大鼠骨质疏松症的最佳治疗效果。