银杏叶提取物对糖皮质激素诱导的骨质疏松症大鼠骨密度和骨生物力学的影响

张家国 徐晓峰 李明 王景靓

大连市第二人民医院骨科，辽宁 大连 116011

低骨量与遗传、营养、生活方式以及雌激素水平和一些药物的使用密切相关。在这些药物中，糖皮质激素具有强效的抗炎作用，并且已经用于治疗慢性疾病以及移植后免疫疗法数十年[1]。目前皮质类固醇的使用与严重的副作用有关，包括骨质疏松症和骨折增加[2]。尽管临床上认识到糖皮质激素可导致骨质流失，但许多长期接受糖皮质激素治疗的患者未评估其骨骼健康状况，也未接受特别的预防或治疗[3-4]。糖皮质激素直接作用于骨细胞，其主要作用之一是通过加速成骨细胞凋亡，减少成骨细胞的功能和数量[5]。Lucinda等[6]所述，成骨细胞的Bax表达在糖皮质激素诱导的骨质疏松症(GIO)中增加。众所周知，细胞凋亡受内在过程的调控，该过程涉及激活可促进细胞死亡的基因[7]。同样，Bcl-2基因家族编码大量蛋白质，包括参与程序性细胞死亡的Bcl-2基因家族的促细胞凋亡蛋白成员Bax[8]。生化标志物在骨质疏松症的处理中也是重要的，骨碱性磷酸酶(bone alkaline phosphatase,BAP) 是其中之一，它是在成骨过程中从成骨细胞释放到血液中的特定酶，被认为是骨矿化过程的指标[9]。双膦酸盐广泛用于预防或治疗骨质疏松症[10]，然而，一些副作用如胃肠不耐症和下颌骨坏死已有报道[11]。因此，需要寻找新的方法来治疗当前的疾病。植物雌激素在骨质疏松症的治疗中显示出显著的结果[12]。同时，Trivedi等[13]表明银杏叶提取物、山奈酚和槲皮素的植物雌激素成分参与骨骼的有益结果。银杏叶(家庭银杏科)是目前由接受不同治疗方法的人群所使用的植物。该植物的主要化合物包含6%的萜类化合物(银杏内酯和白果内酯)、低于5 ppm的银杏酸和24%的植物雌激素。尽管目前缺乏临床前研究以及使用银杏治疗骨质疏松症的临床研究，但少数现有的研究结果显示在治疗骨质疏松症方面其取得了令人鼓舞的结果[14]。银杏叶提取物(ginkgo biloba extract, Gbe)在治疗骨质疏松症中可能起重要作用，部分作者报道了这种提取物的抗凋亡特性[14]。具体而言，Gbe在体外暴露于自由基的作用下可有效保护成骨细胞免于死亡。因此，银杏对刺激成骨细胞分化和增加骨形成是有效的[14]。基于以上研究结果，本研究旨在评估Gbe在生物化学标志物BALP中的作用、对双能X射线吸收测定法(DEXA)检测骨密度(bone mineral density, BMD)以及用GIO处理的SD大鼠胫骨生物力学的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物

雌性SD大鼠(14周龄，重约250～290 g)从Juiz de Fora联邦大学的动物园获得，它们在那里出生并繁殖。将动物置于带有不锈钢丝盖和松木屑作为被褥的透明塑料笼中，生活在具有受控环境条件(12 h光照/12 h黑暗循环，温度22 ℃)的密闭通风货架上的动物房中。所有动物可以自由接近食物和水源。

1.2 实验药物

银杏叶提取物注射液(台湾济生化学制药厂股份有限公司生产，每支含有银杏叶提取物17.5 mg，其中银杏黄酮苷4.2 mg);阿仑膦酸钠片(70 mg/片，杭州默沙东制药有限公司)；地塞米松磷酸二钠(上海北杰集团关东药业有限公司)。

1.3 实验设计

在该实验中，随机选择60只14周龄的动物，均匀分成5组：骨质疏松组[OP组，给予地塞米松磷酸二钠7 mg (kg·d)]；Gbe-1组[给予银杏叶提取物28 mg (kg·d)联合地塞米松磷酸二钠7 mg (kg·d)]；Gbe-2组[给予银杏叶提取物56 mg (kg·d)联合地塞米松磷酸二钠7 mg (kg· d)]；阿仑膦酸钠组[ALN组，给予阿仑膦酸钠0.2 mg (kg· d) 联合地塞米松磷酸二钠7 mg (kg·d)]和对照组(CON组);对照组未接受任何治疗。每组再平均分为治疗4周组与治疗8周组。在骨质疏松症诱导4周后对ALN、Gbe-1和Gbe-2组进行灌胃治疗，每天一次。治疗4周和8周后分别对动物实施安乐死。用180 mg/kg和10 mg/kg剂量的赛拉嗪和氯胺酮进行腹腔麻醉，心脏穿刺取血样5 mL。收集血液后，通过总放血使动物安乐死。将血样在3 000 r/min下离心10 min，并将血清在-80 ℃保存直至分析。检测血清骨特异性碱性磷酸酶(BAP)水平。取出右侧胫骨并在-20 ℃下保存直至分析，然后在室温下解冻4 h。

1.4 骨密度(BMD)检测

胫骨的BMD使用DPX-ALPHA LUNAR TM1通过双能X射线吸收测定法(DEXA)来测量。使用小动物软件进行分析，并对骨进行单独评估。

1.5 生物力学参数

使用DL3000型通用机器EMIC对分离的右胫骨进行三点弯曲测试评估。通用机器以5 mm/min的加载速率装配2 000 N容量的测力传感器。在右胫骨骨干弯曲试验中，支架两点之间的距离标准化为三分之二的试样，并且施加的负荷距各端等距。使用以下结构-机械性能进行测试：弹性(mJ)，其被定义为样品在弹性相中允许的能量；最大载荷(N)和刚度(103N/m)，它被定义为表示结构刚度的载荷和变形之间的关系。

1.6 统计学分析

数据使用(平均值±标准差)表示，使用单因素方差分析(ANOVA)分析统计学显著性，然后进行Tukey/Dunnett’T3事后检验(对照组除外)。使用Student’st-检验将对照组与骨质疏松症组进行比较。P<0.05被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗前后BAP值的改变

治疗4周和8周后，OP组和ALN组显示BAP水平显著降低(P<0.05)，Gbe-1、Gbe-2组的BAP水平明显增加(P<0.05)，见图1。

图1 骨碱性磷酸酶(BAP)的水平(CON组与OP组比较，*P<0.05;除CON组外，所有组均与OP组进行比较，**P<0.05)Fig.1 Bone alkaline phosphatase (BAP) levels

2.2 治疗前后BMD的改变

OP组BMD明显低于CON组(P<0.05)， Gbe-1、Gbe-2和ALN组的BMD在治疗4周和8周显著增加(P<0.05)，见图2。

图2 使用双能X线吸收仪测量骨密度的结果(CON组与OP组比较，*P<0.05;除CON组外，所有组均与OP组进行比较,**P<0.05)Fig.2 Measurements of bone mineral density (BMD) using a dual-energy X-ray absorptiometry bone densitometer

2.3 治疗前后骨生物力学的改变

与CON组相比，OP组显示大鼠胫骨刚度、最大载荷和弹性明显降低(P<0.05)，Gbe-1，Gbe-2和ALN组的刚度、最大载荷和弹性在治疗4周和8周后显著增加(P<0.05)，见图3。

图3 三点弯曲测试的结果(CON组与OP组比较，*P<0.05;除CON组外，所有组均与OP组进行比较,**P<0.05)Fig.3 Results of a three-point bending test

3 讨论

据笔者了解，已经进行的那些用于评估Gbe在骨质疏松症中作用的临床前研究，大多数以卵巢切除诱导骨质疏松大鼠为模型。此项研究是首次评估Gbe对GIO诱导骨质疏松的影响。本研究的目的是通过骨生物力学和BMD来评估Gbe治疗对糖皮质激素诱导的骨质疏松症恢复的效果。在本研究中，通过DEXA评估骨密度，DEXA是骨质疏松症临床评估的金标准。笔者观察到使用糖皮质激素显著降低了大鼠血清BAP、BMD、胫骨的最大负荷、弹性和刚度。用Gbe治疗可有效恢复BAP、BMD水平，表明银杏叶提取物可增加这些动物的骨量。有研究表明[6]银杏叶提取物可以减少成骨细胞的凋亡，而本研究中BAP水平降低在治疗后得到恢复也证实了银杏叶提取物可以促进成骨细胞活性。

骨脆性可以通过生物力学参数来定义，并且受到骨转换、微型结构、矿化、微损伤、胶原交联和矿物晶体结构等多个因素的影响[15]。糖皮质激素与快速和显著的骨丢失以及骨折风险增加密切相关。在本研究中，GIO不仅表明骨密度明显下降，而且显示骨的生物力学参数如骨刚度、最大负荷和弹性下降。Gbe和阿仑膦酸钠不仅增加了BMD，胫骨的生物力学参数也有不同程度的改善。 Sliwiński等[16]的研究显示阿仑膦酸钠治疗股骨干骨矿物质含量增加；笔者的研究显示阿仑膦酸钠对胫骨干的力学性能影响显著。另外，Sliwiński等报告，与去卵巢大鼠相比，股骨颈是一种以小梁骨为主的区域，其负荷显著增加。这些结果表明阿仑膦酸钠和Gbe对骨小梁和骨皮质的影响都较大，皮质骨存在于长骨的骨干中，如同一些研究人员所得出的研究结果[17]，其缺乏骨密度和骨折风险之间的相关性。

虽然BMD测量是骨质疏松症诊断中最重要的工具之一，但它越来越清楚地表明其并不能反映骨强度的所有成分。对于骨质疏松症的治疗药物，如双膦酸盐，已显示其对骨密度的改善；然而，这些变化仅提供关于骨小梁损失或其数量的信息，并不能完全说明包括皮质骨在内结构变化的机械性质的改变[18]。例如，用利塞膦酸钠治疗的患者骨密度增加与骨折发生率无关[18]。但此次研究的数据显示Gbe和阿仑膦酸钠除了对BMD的改善，也会影响生物力学特性。据笔者所知，此次研究首次评估了Gbe对胫骨干骨生物力学参数的影响，结果表明Gbe显著增加了生物力学参数。此次研究结果表明治疗时间和Gbe的剂量虽然不足以完全恢复胫骨的皮质骨，但是相同剂量和时间的Gbe治疗对牙槽骨有着良好的效果[14]。Trivedi等[13]报道了较高剂量[100 mg (kg·d)] Gbe对卵巢切除大鼠的胫骨皮质骨增加更为显著。

总之，用GIO进行治疗将降低骨密度和骨生物力学参数，如骨硬度、最大负荷和弹性。此次研究的结果表明Gbe可以部分恢复大鼠的BMD，但胫骨生物力学参数没有改善。