续苓健骨方对去卵巢骨质疏松模型大鼠血液钙磷代谢的影响

陈赛楠 吴华嵩 程佑民 叶云金 李生强 谢丽华 陈娟 葛继荣

福建省中医药研究院骨质疏松证候基因组学重点研究室，福建 福州 350003

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)属Ⅰ型高转换型原发性骨质疏松症，是由于绝经后卵巢功能衰退、雌激素水平降低引起的骨吸收亢进，进而骨重建失衡导致骨量降低、骨微结构破坏、骨折风险性增加的全身性骨骼疾病[1]。随着人口老龄化程度加剧，其发病率逐年上升，骨折致畸、致残是最常见且最严重的并发症，严重影响老年人的生活质量[2]。骨质疏松症病因多与性别、营养、内分泌、遗传等因素密切相关[3]，其发病机制较为复杂，钙代谢紊乱是重要的病理机制之一[4]，因此纠正机体负钙代谢是防治PMOP的有效措施之一。

中医理论认为骨质疏松症的发生与肾、脾关系密切，肾主骨生髓，肾精亏虚不足以充养骨髓，“肾为先天之本”“脾为后天之本”，肾脾相互影响，互为因果。肾虚可致脾虚，脾失运化，脾气不足，则骨髓空虚、骨骼失养而成骨痿。续苓健骨方是葛继荣教授长期致力于骨质疏松症中药新药临床试验并结合临床实践，依据补肾壮骨、益气健脾、活血祛瘀而提出的指导用药，是治疗绝经后骨质疏松症肾虚血瘀证的中药验方，辨证论治、整体调控，可有效提高患者骨密度、缓解临床症状。为进一步探讨其治疗机制，本实验采用双侧卵巢切除术建立大鼠骨质疏松模型，观察续苓健骨方对大鼠胫骨骨密度、胫骨组织显微结构、骨代谢指标TRAP、血钙和血磷含量的影响，探讨续苓健骨方防治绝经后骨质疏松症的潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级3月龄未孕雌性SD大鼠40只，体重(240±10)g，购自上海禹堃实验动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2016-0003。实验动物饲养于福建省中医药研究院比较医学中心，合格证号：医动学第23-016号。

1.1.2 实验药物：续苓健骨方由骨碎补、茯苓、白术、陈皮、赤芍和甘草等12味中药组成，每剂总重量122 g，购自福建鹭燕中宏医药有限公司；碳酸钙D3片(Ⅱ)，规格：钙500 mg、维生素D3200 IU，北京康远制药有限公司，批准文号：国药准字H20093675，批号：20170328。

1.1.3 主要试剂与仪器：戊巴比妥钠(Sigma-Aldrich)、多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司)、乙二胺四乙酸二钠(国药集团化学试剂有限公司)、无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)、抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒(碧云天生物技术)、钙测试盒(南京建成生物工程研究所)、磷测试盒(南京建成生物工程研究所)、酶标仪(BIO-TEK,LX-800)、双能X线骨密度仪(HOLOGIC,Discovery WS/N 89006)、组织脱水机(亚光,ZT-14V2)、石蜡包埋机(亚光,YB-7LF)、石蜡切片机(Leica,RM2255)、玻片数字扫描仪(3D HISTECH,Pannoramic 250,Pannoramic MIDI)。

1.2 方法

1.2.1 模型制备：SD大鼠饲养至6月龄，随机分为假手术组、骨质疏松模型组、续苓健骨方组、碳酸钙组，每组10只。除假手术组外，其余组行双侧卵巢切除术制备模型[5]。术前一天禁食不禁水，称重，2%戊巴比妥钠按0.2 mL/100 g剂量行腹腔注射麻醉，仰卧位固定，备皮，于腹部正中线作一长约1.5 cm的切口。沿腹白线打开腹腔，沿Y型子宫寻找双侧粉红色桑葚状卵巢，结扎，彻底摘除卵巢，逐层缝合，术后肌注青霉素8万单位，连续3 d。假手术组采用相同手术方法，切除卵巢附近相等量脂肪组织。

1.2.2 药物干预：于术后4周进行药物干预，大鼠灌胃剂量根据实验动物体表面积换算，续苓健骨方组灌胃剂量为12.71 g/(kg·d)，碳酸钙组灌胃剂量为104.19 mg/(kg·d)，假手术组、模型组给予等量生理盐水灌胃，每日1次，连续灌胃12周，于灌胃结束后取材。

1.2.3 血清生化：行腹主动脉采血，全血静置2 h，3 000 r/min、离心10 min。吸取血清，严格按照抗酒石酸酸性磷酸酶、钙、磷测试盒说明书操作，酶标仪测定样本吸光度，绘制标准曲线，计算血清抗酒石酸酸性磷酸酶、钙、磷含量。

1.2.4 骨密度测量：取左侧胫骨，尽量去除肌肉、周围软组织，用生理盐水沾湿纱布包裹保存，固定位置。双能X线骨密度仪采用小动物扫描模式，自选工具选定ROI区域，读取样本骨密度，打印测量结果。

1.2.5 病理学观察：取右侧胫骨置4%多聚甲醛中常温固定48 h，10% EDTA(pH 7.2～7.4)脱钙，每3日更换一次，常温脱钙6周至刀切无阻力感。水洗，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，胫骨冠状面为切面，4 μm厚连续切片，60 ℃拷片2 h，切片脱蜡至水，Bouin’s固定液固定1 h，水洗至无色，丽春红染液染色10 min，水洗，磷钼酸分色镜下控制，固绿染液染色3 min，水洗，中性树脂封片，玻片明场全视野扫描，观察骨组织显微结构。

1.3 统计学分析

图1 胫骨近端冠状面(Masson染色，×0.7、×100)(黑色箭头：骨骺线)Fig.1 The coronal plane of proximal tibia (Masson staining, ×0.7, ×100)

2 结果

2.1 骨密度

与假手术组相比，模型组胫骨骨密度显著降低(P<0.01)，提示绝经后骨质疏松症模型复制成功；与模型组相比，续苓健骨方组骨密度提高(P<0.05)，碳酸钙组骨密度略有提高，但差异不具有统计学意义；结果显示续苓健骨方的药效作用，见表1。

2.2 病理学观察

胫骨Masson染色可见假手术组骨骺线(黑色箭头)下骨小梁量多、紧密，排列规则、分布均匀，骨小梁间距小，相互连接成网状，骨髓腔未见明显脂滴聚集(图1 A)。模型组可见骨小梁稀疏，排列不规则、分布不均匀，骨小梁间距显著增加，可见骨小梁断点，骨小梁丢失部位以髓腔正中最为显著、依次向腓骨侧扩散，骨髓腔内可见脂滴显著增加(图1B)。与模型组相比，续苓健骨方组骨小梁数量增加，分布较均匀，骨小梁间距缩小，髓腔内脂滴数量较少(图1C)；碳酸钙组骨小梁疏松程度介于模型组和续苓健骨方组之间，骨组织结构达到一定程度的改善(图1D)。

组别BMD假手术组0.4168±0.0212**模型组0.3321±0.0101##续苓健骨方组0.3671±0.0135*碳酸钙组0.3494±0.0149##统计值0.000

注：与假手术组相比，#P<0.05;与假手术组相比，##P<0.01；与模型组相比，*P<0.05;与模型组相比，**P<0.01。

于骨骺线下中央部位镜下(×50)计算骨小梁面积，与假手术组相比，模型组骨小梁面积显著降低(P<0.01)；与假手术组相比，续苓健骨方组(P<0.01)、碳酸钙组(P<0.05)骨小梁面积上升，见表2。

表2 大鼠胫骨骨小梁面积Table 2 Results of tibia trabecular area in the rats

注：与假手术组相比，#P<0.05;与假手术组相比，##P<0.01；与模型组相比，*P<0.05;与模型组相比，**P<0.01。

2.3 血清生化

与假手术组相比，模型组TRAP活性显著升高(P<0.01)；与模型组相比，续苓健骨方组TRAP活性降低(P<0.05)，碳酸钙组TRAP活性稍降低，但差异没有统计学意义。结果显示续苓健骨方可降低破骨细胞活性，降低骨吸收量。与假手术组相比，模型组血钙降低(P<0.05)、血磷升高(P<0.05)；与模型组相比，续苓健骨方组血钙升高(P<0.05)、血磷降低(P<0.05)，碳酸钙组血钙稍升高、血磷稍降低，但差异没有统计学意义。结果显示续苓健骨方在一定程度上恢复了钙磷代谢稳态。见表3。

组别TRAP血钙血磷假手术组 24.8685±3.6685**2.5728±0.3534*2.5945±0.2061*模型组 34.8856±7.5827##2.278±0.0786#2.9519±0.2183#续苓健骨方组28.8877±4.5355#*2.4163±0.2263*2.6125±0.3278*碳酸钙组 31.6902±5.1974#2.361±0.11482.7156±0.4323统计值 0.0070.0210.066

注：与假手术组相比，#P<0.05;与假手术组相比，##P<0.01；与模型组相比，*P<0.05;与模型组相比，**P<0.01。

3 讨论

骨质疏松症(osteoporosis,OP)中以绝经后骨质疏松症多见，钙磷代谢紊乱是重要病理机制之一。钙是人体的必需元素，99%的钙以羟磷灰石结晶的方式储存于骨组织中，1%的钙分布于体液和软组织中，两者处于动态平衡；游离钙是重要的第二信使，参与凝血、肌肉收缩等重要生理过程[6-7]。磷也是人体的必需元素，86%的磷以磷酸钙形式存储于骨组织中，14%的磷分布于细胞中，是核酸、三磷酸腺苷和骨骼等组织的重要组成部分，参与并维持机体正常生理功能。磷需协同钙和维生素D共同维持其正常的生理功能[8]。机体内存在精细的钙磷平衡调节机制，肠、肾、骨是调控钙磷代谢的主要靶器官[9]，1,25(OH)2D3[10]、甲状旁腺素(PTH)[11]、降钙素(CT)[9]是调控钙磷代谢的主要激素，协同调控血钙磷吸收、尿钙磷重吸收与排泄、骨钙磷沉积与释放，共同维持机体内的钙磷代谢平衡。

雌激素是重要的骨代谢调控激素，对钙磷代谢起着重要的调控作用[12]。雌激素对骨组织的主要作用是抑制骨吸收，作用一为促进1,25(OH)2D3合成，增加肠钙吸收，有利于骨钙沉积；作用二是降低机体对PTH的敏感性，降低升钙降磷作用，抑制骨吸收；作用三是促进CT分泌，抑制破骨细胞活动，降低骨钙释放入血。绝经后雌激素水平急速降低，1,25(OH)2D3合成降低，PTH敏感性升高，CT抑制破骨细胞作用减弱，引起的肠钙吸收减少，尿钙重吸收率降低、排泄增加，骨吸收和骨形成失衡，骨重建呈高转化，骨吸收、骨形成均增强，但骨吸收作用强于骨形成作用。正常人血清钙磷乘积是35～40，钙磷比值影响骨代谢[13]；血清钙与血清磷呈负相关，血清钙降低则血清磷升高，血清钙升高则血清磷降低；低钙高磷引起PTH分泌增加，导致骨吸收作用加强、骨重建紊乱，从而影响骨密度[14]。

中医将骨质疏松症归“骨痿”“骨枯”范畴，病变在骨，病位在肾，与肝脾胃紧密相关。肾精亏虚、脾胃虚弱、气滞血瘀为主要病机，采用补肾填精、健脾和胃、活血散瘀的治则，选用续苓健骨方为临床治疗绝经后骨质疏松症肾虚血瘀证验方，以续断、骨碎补为君药，补肝肾强筋骨;白术、茯苓、陈皮为臣药，益气健脾;配赤芍清热凉血、女贞子等为佐药，滋阴补肾;甘草为使药，调和药性。共奏补肾壮骨、益气健脾、活血通络止痛之功效。本实验结果显示，与假手术组相比，模型组骨小梁数量显著下降，血钙降低而血磷升高，钙磷代谢紊乱，呈负钙平衡状态；经续苓健骨方干预12周后，血钙升高而血磷降低，经双能X线骨密度仪测量显示骨密度升高，且经Masson染色显示骨小梁数量和分离度具有了改变。结果表明本方在一定程度上纠正了负钙平衡，恢复了钙磷稳态，下调了骨重建速率以改善去卵巢大鼠骨质疏松状况。药理研究表明，章轶立等[16]筛选出骨碎补治疗OP的4个关键作用靶标：甲状旁腺素1受体(PTH1R)、甲状旁腺素2受体(PTH2R)、降钙素受体基因(CALCR)、SPTBN1基因(SPTBN1)[15]；白术提取物(AMK)可通过调节小肠上皮细胞(IEC-6)发挥黏膜保护和修复作用；茯苓多糖对肠道黏膜免疫系统具调节作用[17]；女贞子粗提物可促进维生素D受体和钙结合蛋白表达，促进肠钙吸收，抑制尿钙排泄[18]。单纯碳酸钙D3片(Ⅱ)的治疗对骨量影响较为有限，不能预防50岁以上人群骨折的发生[19]。补钙属于骨质疏松症的基础治疗，应根据骨质疏松症的类型，选用双膦酸盐类[20]、选择性雌激素受体调节剂[21]、PTH[22]等药物共同进行治疗。

本实验结果初步显示了续苓健骨方能够通过调控钙磷代谢从而提高去卵巢大鼠骨密度并改善骨组织微结构，但如何调控钙磷代谢，是否通过促进肠钙吸收、降低尿钙排泄、促进骨钙沉积等问题，还需后续进一步深入研究来探讨其调控机制，为续苓健骨方的临床应用提供实验基础。