5种细菌对苹果轮纹病菌菌丝的拮抗作用

侯晓杰，梁魁景，于占晶

（衡水学院生命科学系，河北 衡水053000）

苹果是我国主栽的经济作物之一。随着苹果种植面积的不断扩大，苹果轮纹病的危害日益严重，我国山东、辽宁、河北等地区均有发生，极大地影响果品产量和质量，造成重大的经济损失。苹果轮纹病一旦发生，轻则削弱树势，重则导致枯枝、死树。据调查发现，我国苹果果园总体发病率在70%以上，一般年份苹果产量损失20%～30%，多雨年份则达到40%～60%[1]。

目前对苹果轮纹病的防治主要是化学防治。化学农药虽然有见效快、使用方便、可大规模应用等优点，但容易对环境造成污染和残留在果品上，危害人类的健康。此外，化学药剂的大量使用还会诱导病菌产生抗药性。因此，采取一种高效、无毒、无污染的防治策略将成为研究防治苹果轮纹病的重中之重[2]。生物防治是指利用拮抗性微生物而降低有害生物的作用，使其有益于有益生物[3]。拮抗微生物的拮抗机制主要通过生防细菌产生抗生素、 微生物之间的竞争作用及诱发植物自身的抗病性这3 种方式发挥拮抗植物病害的作用。目前已有研究发现，利用荧光假单胞杆菌（Pseudomonas fluoreseus）防治小麦全蚀病[4]，利用枯草芽孢杆菌B-903 抑制苹果轮纹病菌菌丝的扩散[5]。生物防治无残留、无污染，对人和牲畜都没有伤害，且能够不伤害天敌和有益生物，保护自然生态平衡。植物内生菌作为一种天然生防菌，对于防治植物病害具有重要的意义[6]，有很大的开发应用前景，是值得人们努力研究探索的一个方向。目前虽然国内外对植物内生菌的研究报道很多，但是利用微生物资源防治苹果轮纹病的研究报道还很少。本文主要以苹果的真菌病害为主要研究对象，利用对峙试验的方法，从黄顶菊分离出来的花2、茎1、茎2、茎4 及从姜内分离出的姜4，共5 种内生细菌，从中筛选出对苹果轮纹病具有广谱拮抗能力的细菌，为开发绿色、高效、安全的新型微生物杀菌剂提供基础。

1 材料与方法

5 种拮抗细菌如上述。苹果轮纹病病菌由衡水学院生命科学系园林植物学实验室提供。

1.1 5 种内生细菌的活化

从冰箱中取出保存备用的5 种内生菌（茎1、茎2、茎4、花2、姜4），在无菌操作台酒精灯周围，将接种环放在酒精灯火焰上方灼烧至通红，待其冷却后将接种环深入细菌培养皿，轻轻挑取细菌划线到新的NA 固体平板上培养，每种细菌重复3 次。接种后，将其放置到28 ℃恒温生化培养箱中培养4～5 d。

1.2 苹果轮纹病菌的复壮

首先需要对保存在低温环境中的苹果轮纹病菌进行活化。在超净工作台上，首先用火柴点燃酒精灯，在酒精灯外焰上灼烧打孔器，待打孔器冷却，在酒精灯周围用打孔器在培养皿边缘打出直径为1 cm 的菌饼，然后将菌饼置入PDA 固体培养基，将培养皿置于28 ℃恒温生化培养箱中培养4～5 d，观察病原菌的生长情况。

1.3 苹果轮纹病病菌菌丝生长的抑制试验

细菌菌悬液的制备： 在无菌操作台上的酒精灯周围，往培养好的细菌培养皿中注入适量无菌水，用玻璃棒轻轻刮取细菌，使其混在无菌水中，并用移液枪吸取，将其转移至三角瓶中，密封。将三角瓶放置到振荡器振荡1 min，使细菌与水混合均匀。再用移液枪吸取振荡好的菌悬液，滴入比色杯中，再将比色杯放入722分光光度计中，测定其OD 值，并不断调整浓度，使其最终的OD 值为1.000。密封备用。

对峙培养：用酒精灯外焰灼烧打孔器灭菌，待打孔器冷却后，在超净工作台上的酒精灯周围，用直径为1 cm 的打孔器在活化后的苹果轮纹病培养基上打孔，挑取菌饼倒扣在新的PDA 平板上。在平板的外围分别均匀放置3 个滤纸片，打开装有菌悬液的三角瓶，用移液枪吸取制备好的细菌菌悬液50 μL，分3 次将其滴在滤纸片上，每种细菌重复3 次。同时用无菌水作对照。将所有的PDA 平板置于28 ℃的恒温生化培养箱中培养4～5 d。

1.4 抑菌圈直径的测定

5 种内生细菌与苹果轮纹病病菌进行对峙培养试验，对苹果轮纹病病菌进行拮抗测定。测定苹果轮纹病病菌菌落直径，计算抑菌效果。

用Excel 软件对数据进行处理和作图，用Spss17.0进行方差分析，差异显著性水平位5%（p≤0.05）。

2 结果与分析

由表1可知，5 种内生细菌对苹果轮纹病菌均有抑制作用，其中从黄顶菊花内分离的花2 对病原菌的拮抗性最大，抑制效果最好；从姜内分离的姜4 和从黄顶菊内分离的茎2 次之； 抑制效果最差的则是从黄顶菊内分离的茎1。平均抑菌率依次为55.026%、46.032%、44.444%、34.391%、26.455%前三者间差异不显著，但显著高于后二者；后二者间差异不显著。

表1 5 种内生细菌对苹果轮纹病菌菌丝生长的抑制效果

3 小结与设想

植物病害的生物防治相较化学防治具有无与伦比的优势，已成为当今研究的热点。但植物内生菌作为生防因子应用的潜力还未完全开发出来，多数生防制剂的效果还不能令人满意。本试验研究表明，花2、茎2 和姜4 对苹果轮纹病菌菌丝具有良好的拮抗作用，这为进一步研究防治苹果轮纹病的有效生物制剂奠定了基础。今后要对苹果轮纹病菌菌丝拮抗效果好的内生细菌进行形态学和生物学上的鉴定，同时分析黄顶菊和姜内分离的内生细菌起拮抗作用的成分，并研究其拮抗机理。