基于PCR-DGGE方法分析泡菜中乳酸菌群落结构

燕平梅，宋敏丽，乔宏萍，赵文婧，陈燕飞

(1.太原师范学院 生物系，太原 030619; 2.土壤消毒活化绿色产业技术创新战略联盟，太原 030619)

我国地大物博，蔬菜年产量数亿吨，居于世界前列。但由于生产落后，缺少贮藏手段，使得每年的蔬菜损失重大。泡菜在我国具有悠久的历史，泡菜的存在大大降低了蔬菜的浪费，由于其加工简单，味道鲜美，富含维生素、纤维素和蛋白质等营养物质[1]，具有清肠、抗癌、抗肥胖等功能[2,3]，固而受到人们的青睐。

泡菜是我国传统的蔬菜发酵食品，主要进行乳酸发酵。Jung S L等的研究表明乳酸菌是泡菜发酵的主要微生物[4,5]。在发酵过程中以乳酸菌等有益微生物群体稳定且占绝对优势，几乎不发生污染，发酵产物甚至可以不用消毒。泡菜中的乳酸菌对泡菜的色、香、味、品质至关重要[6]，这主要是由于在泡菜的制作过程中，乳酸菌的代谢产物和所处的低氧环境抑制了有害微生物的生长。首先乳酸菌产酸和一些呈味物质，其次乳酸菌不能分解纤维素，这使得泡菜有良好的外观[7]。总而言之，乳酸菌的种类和特性与泡菜的风味和品质紧密相关。我国传统的自然发酵很难满足人们对泡菜的需求，而且发酵时间长，会使亚硝酸盐这种致癌物质大量积累，危害人们的健康。因此，将泡菜投入到工业化生产是十分必要的。韩国泡菜、日式泡菜工业化生产已经达到了成熟阶段，而中国如四川泡菜的工业化生产仍处于起步阶段，还有待进一步发展。本实验利用PCR-DGGE技术可以分离出两种市售泡菜中不同种的乳酸菌，不仅了解泡菜中乳酸菌的种类和分布，而且为泡菜工业化生产筛选和培育优良乳酸菌种奠定了基础。

张庆芳等人的研究表明乳酸菌能够降解亚硝酸[8]。这是由于乳酸菌产酸，使得发酵体系中的pH升高，可以抑制其中有害微生物的生长，如能够产生硝酸还原酶的微生物，它们可以将泡菜中富集的硝酸盐还原成亚硝酸盐。同时在H+的作用 下，将NO2-还原成NO-，降低了亚硝酸盐的含量。亚硝酸盐能与胺类物质生成亚硝胺，亚硝胺摄入会对人体造成危害，是一种毒性很强的致癌物质；另外亚硝酸盐易引起高铁血红蛋白症，使生物组织缺氧、血管扩张、血压降低[9]。如果能够将降解亚硝酸盐能力强的乳酸菌株应用于泡菜发酵，这对我国泡菜的生产及推广具有重要的意义。

自1993年 Muyzer等将变性梯度凝胶电泳技术引入到微生物生态学研究以来，DGGE 已被广泛应用到各种各样的生态系统中微生物群落结构分析[10]。由于自然界中只有极其少的微生物能够通过培养法培养[11]，用传统的分离培养方法研究泡菜中微生物种群构成易造成微生物多样性丢失。梁新乐等人的研究表明PCR-DGGE是研究传统发酵食品中微生物组成的可行性方法[12]。因此，本实验采用PCR-DGGE技术来更加全面地反映泡菜中乳酸菌的多样性。

1 材料与方法

1.1 样品

市售白菜泡菜(青岛松源食品有限公司)，用P1表示；泡酸菜(四川广乐食品有限公司)，用P2表示。

1.2 仪器与设备

TC-96/G/H(b)B Life Touch基因扩增仪 杭州博日科技有限公司；电泳仪、凝胶成像系统DcodeTMBio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 泡菜卤亚硝酸盐及食盐浓度的测定

泡菜卤食盐浓度测定方法采用硝酸银滴定法。亚硝酸盐测定方法按GB/T 5009.33-1996的方法。

1.3.2 泡菜卤中微生物总DNA的提取及16S rDNA V7-V8片段的PCR

使用细菌基因组DNA提取试剂泡菜中细菌的DNA。

16S rDNA V7-V8片段的引物分别为：

WBAC1:CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCCCGGGAACGTATTCAC-CGCG；WBAC2:GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGA。

PCR反应体系中引物1 μL(10 μL)，模板DNA1.5 μL，Mix 12.5 μL，加双蒸水至25 μL。PCR反应后用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察。

1.3.3 变性剂梯度凝胶电泳分离16S rDNA基因(DGGE)

变性梯度凝胶的配方见表1。

表1 变性梯度凝胶的配方Table 1 The formula of denaturing gradient gel

DGGE电泳后，将可看到的电泳带切割回收，作为模板进行PCR反应，将扩增后的16S rDNA V7-V8片段与pGM-T Vector连接，转化感受态细胞。检测阳性克隆，进行基因序列测定。

1.3.4 DGGE条带结构多样性分析

DGGE图谱上每个条带的位置和相对光密度值被该Quantity One软件自动分析确定。数据的标准化处理用电泳条带的光密度峰值除以该条带所在泳道所有条带光密度峰值的平均值。DGGE泳道内的电泳条带数量用以计算物种丰富度(Species Richness，用R表示)，运用电泳条带相对密度值计算物种均匀度(Species Evenness，用E表示)及物种多样性(Shannon，用H表示)。3种生态指数的计算公式为：

H=-∑(ni/N)In(ni/N)；

E=H/InS；

R=S-1/InN。

式中：ni为单一条带的峰面积，N为某一泳道的所有峰面积，S为某一泳道的总条带数。

1.3.5 系统发育分析方法

将得到的16S rDNA V7-V8目的片段序列提交到GenBank中进行BLAST比对，选出与目的片段相似度高的序列，利用MEGA 4.0软件的Neighbor-Joining法构建16S rDNA的系统发育树，进行系统发育分析。

2 结果及分析

2.1 泡菜中食盐浓度和亚硝酸盐的含量

采用滴定方法测定两种泡菜的氯化钠浓度，结果见表2。泡菜P1的食盐浓度是P2的2.11倍。

采用分光光度法测定两种泡菜的亚硝酸盐含量，结果见表2。泡菜P1的亚硝酸含量是P2的2.35倍。但是两种泡菜中亚硝酸盐含量远低于我国GB 2762—2012中规定的亚硝酸盐限量指标(20 mg/kg)。

表2 不同泡菜中食盐含量Table 2 The salt content in different pickles

2.2 PCR-DGGE实验结果

2.2.1 泡菜中16S rDNA V7-V8片段的PCR扩增

将从泡菜汁中提取出的DNA用25 μL的反应体系进行PCR扩增，所用的引物为WBAC1和WBAC2，再将扩增出的PCR产物进行电泳分析，结果见图1。

图1 16S rDNA片段的PCR扩增 琼脂糖凝胶电泳图谱Fig.1 The agarose gel electrophoresis map of 16S rDNA fragment by PCR amplification

由图1可知，16S rDNA V7-V8区的扩增片段的大小在370～380 bp左右。扩增条带清晰、无杂带，能够进行DGGE实验。

2.2.2 泡菜16S rDNA V7-V8基因的DGGE分析

DGGE电泳结果中，有不同迁移率和明亮程度不同的电泳条带，每一全条带代表不同种属的乳酸菌，电泳条带亮度程度反映了乳酸菌的相对数量，条带越亮，表示该种属细菌的相对数量越多。

图2 泡菜中乳酸菌16S rDNA片段的DGGE图谱Fig.2 DGGE map of 16S rDNA fragment of Lactobacillus in pickles

由图2可知，本次实验共检测出了10个条带。泡菜P1检测到3条带A、B、C，即有3种乳酸菌；泡菜P2检测到7个条带D、E、F、G、H、I、J，即有7种乳酸菌。说明泡菜P2中的乳酸菌种类较泡菜P1中的丰富。A与H位置相同，为同一种乳酸菌。P1中A和C的亮度最亮，说明乳酸菌A和C是泡菜P1乳酸菌中的优势种；P2中J的亮度最亮，说明乳酸菌J是泡菜P2乳酸菌中的优势种。可见，同一种乳酸菌在不同的泡菜中所处的地位是不同的。

2.2.3 泡菜中乳酸菌群落特征

通过Quantity One软件分析DGGE电泳图谱，以电泳条带数量计算物种丰富度，以电泳带相对密度值计算乳酸菌均匀度及多样性。多样性指数、均匀度和丰富度3种生态指数是衡量群落的种类数、个体总数以及各种群均匀程度的量化指标，反映群落结构特征的量度值、群落结构的特征及差异性。泡菜P2中乳酸菌多样性指数和丰富度指数显著高于泡菜P1，均匀度指数无显著差异，见表3。

表3 泡菜微生物乳酸菌群落结构特征Table 3 The community structure of characteristics of lactic acid bacteria in pickles

3 讨论

本实验以市售的两种泡菜为研究对象，测定不同泡菜的食盐浓度及亚硝酸盐含量，运用PCR-DGGE技术分析了这两种泡菜中乳酸菌的多样性，多方面结合比较。泡菜P1中的食盐浓度和亚硝酸盐含量都高于泡菜P2，而泡菜P1中的乳酸菌丰富度低，这是由于高盐导致乳酸菌受到抑制，而乳酸菌又能够降解亚硝酸盐。

食盐含量对微生物群落结构影响很大[13]。泡菜微生物群落成员对食盐浓度的耐受性不同。通常高浓度食盐(10%～16%)有利于酵母菌生长，而低浓度食盐(5%～8%)则有利于乳酸菌生长[14]。在低温下，6%的食盐浓度比8%的能更好地促进乳酸菌生长。

自从PCR-DGGE技术应用于研究微生物物种的多样性，对发酵食品中微生物的物种多样性研究甚多。对其中乳酸菌的多样性研究也颇多，如蒋厚阳运用PCR-DGGE对西藏传统发酵乳制品中的乳酸菌多样性进行了研究[15]。相比之下，本实验的不足：没有对DGGE的条带进行测序，只对DGGE的图谱进行了分析，利用Quantity One软件分析了PCR-DGGE的图谱，计算出了反映乳酸菌多样性的指数。