14 种柑橘皮中多甲氧基黄酮成分分析

许 引，吕小健，李 明*，龙 涛，徐兰英，李士明,*

（1.武汉纺织大学化学与化工学院，湖北 武汉 430200；2.黄冈师范学院化学化工学院，催化材料制备及应用湖北省重点实验室，湖北 黄冈 438000）

柑橘属植物的果皮具有很高的药用价值。例如，陈皮为芸香科柑橘属植物橘（Citrus reticulata Blanco）的干燥成熟果皮，可药食两用。传统医学认为，陈皮性温味苦辛，可归为脾肺两经，具有疏肝理气功效。陈皮及其他柑橘皮的特征成分为黄酮类化合物：多羟基黄酮化合物[1-2]、多甲氧基黄酮以及羟基多甲氧基黄酮[3-7]，例如川陈皮素可以抑制NF-κB，降低Cox-2和iNOS等炎症介质的产生[8-9]；可抑制清道夫受体表达，抑制血脂对靶细胞的攻击[10-11]；橘皮黄酮可以有效抑制血小板聚集，防止心血管栓塞发生等[12]；川陈皮素和陈皮素能够调节脂肪细胞因子的分泌和脂肪细胞的增大[13]；橘皮黄酮可直接对抗肥胖，降低实验动物甘油三酯和胆固醇的水平[14]。

近期研究表明，橘皮中橘皮素、川陈皮素和3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮等多甲氧基黄酮，以及5-去甲基川陈皮素等羟基多甲氧基黄酮是柑橘属植物果实皮的特有成分[3]。研究发现，陈皮的药效及重要生物活性大多与其含有的黄酮，特别是与多甲氧基黄酮相关[15-16]。同样，柑橘果皮中多甲氧基黄酮的种类和含量受柑橘种类和多种生长环境因素的影响。柑橘果皮来源选材不同，其中多甲氧基黄酮种类和含量也会不同，进而影响橘皮的药效[17]。因此，分析不同品种、不同产地柑橘果皮中多甲氧基黄酮含量，对于橘皮的选材及多甲氧基黄酮的质量控制具有重要意义。

目前，国内外对柑橘果皮尤其是陈皮的研究逐渐增多，但研究多集中于其中一个或几个常见品种[18]，鲜少有对不同品种的柑橘果皮、陈皮中的多甲氧基黄酮成分进行综合考察分析。文献多报道橘皮总黄酮含量的测定，方法主要有分光光度法[19-20]、二氯氧锆比色法[21]、薄层色谱法[22-23]，以及运用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）、液相色谱-质谱联用技术测定橘皮中常见的多甲氧基黄酮，如川陈皮素、橘皮素和3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮含量的测定方法也有报道[24-27]，但是3,5,6,7,3’,4’-六甲氧基黄酮、5,6,7,4’-四甲氧基黄酮和5-去甲基橘皮素相关定量分析的报道很少。本实验建立同时测定橘皮中9 种多甲氧基黄酮（结构式见图1）含量的方法，以期为多甲氧基黄酮柑橘皮原材料选材、质量合理控制提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 标准品

9 种多甲氧基黄酮标准品，包括5,6,7,4’-四甲氧基黄酮、甜橙黄酮、橘皮素、3,5,6,7,3’,4’-六甲氧基黄酮、川陈皮素、3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮、5-去甲基橘皮素、5-去甲氧基川陈皮素、5-羟基-3,6,7,8,3’,4’-六甲氧基黄酮，为实验室自制，纯度均大于98.5%。

1.1.2 柑橘皮及陈皮

新鲜柑橘共11 种，包括2 种橙类（安远脐橙、赣南脐橙）；3 种柑类（重庆柑橘、蒲江丑橘、广西皇帝柑）；5 种橘类（蒲江美人橘、广西沙糖橘、台州蜜橘、宜昌蜜橘、黄冈本地橘）；金钱橘，购买于京东生鲜水果超市，由黄冈师范学院生命科学学院鉴定确认。新会陈皮、江西陈皮、浙江陈皮购于湖北黄州大药房。

图 1 9 种多甲氧基黄酮的结构式Fig. 1 Chemical structures of nine polymethoxyflavonoids (PMFs)

1.1.3 试剂

无水乙醇（分析纯），甲醇、乙腈（均为色谱纯）上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

1260 II HPLC仪 美国安捷伦公司；GWX-9623MB型电热鼓风干燥箱、DZF-6020真空干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SHZ-III循环水真空泵、RE-52AA型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；CCA-20型低温冷却水循环泵 巩义市予华仪器有限责任公司；BSA124S分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；DS-5510DT型超声波清洗器 上海生析超声仪器有限公司；UPT-II-10T优普系列超纯水器成都超纯科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HPLC条件

HPLC色谱柱：Phenomenex Luna C18（2）液相色谱柱（150 mm×4.6 mm，3 µm）；流动相为水（A）和乙腈（B）。流动相洗脱梯度为：0～15 min，40%～55% B；15～20 min，55%～70% B；20～25 min，70%～80% B；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：326 nm；进样量：10 μL。

1.3.2 对照品溶液的制备

分别精确称取一定质量的甜橙黄酮、5,6,7,4’-四甲氧基黄酮、橘皮素、3,5,6,7,3’,4’-六甲氧基黄酮、川陈皮素、3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮、5-去甲基橘皮素、5-去甲基川陈皮素和5-羟基-3,6,7,8,3’,4’-六甲氧基黄酮9 种标准品，用乙醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，配制成一定质量浓度范围为1.187～840 μg/mL对照品溶液。将对照品溶液用0.22 μm微孔滤膜滤过，用HPLC分析检测，并建立相对应的回归方程。

1.3.3 柑橘类果皮中多甲氧基黄酮的提取

1.3.3.1 超声提取多甲氧基黄酮

以广西砂糖橘、新会陈皮及广西皇帝柑为例，分别采用回流提取、超声提取、索氏提取、微波提取、超临界提取等提取方法，对不同提取时间、温度、超声功率、料液比、提取溶剂等因素做单因素试验探究总目标多甲氧基黄酮提取率，以提取率为主要指标，综合考虑提取方法，选择以无水乙醇作溶剂、料液比1∶10（g/mL）、超声提取柑橘果皮中多甲氧基黄酮化合物，超声时间40 min，超声功率450 W，超声频率40 kHz。

1.3.3.2 样品的制备

将各果实样品洗净，收集的果皮于60 ℃干燥2～3 周，然后将干燥果皮粉碎备用；新会陈皮、浙江陈皮、江西陈皮直接粉碎成粉末备用。称取干燥柑橘果皮粉末各4.0 g，用40 mL无水乙醇按1.3.3.1节超声提取40 min，放冷，过滤，滤液置50 mL容量瓶中，用少量乙醇分数次洗涤容器，洗液滤入同一量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液，4 ℃保存备用。每种柑橘果皮提取实验平行3 组。

1.3.4 柑橘类果皮中多甲氧基黄酮的检测

将供试品溶液过0.22 µm滤膜后直接注入进样瓶进行HPLC分析，以标品溶液质量浓度（µg/mL）为横坐标、对应峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并进行回归计算得9 种多甲氧基黄酮回归方程，检测5,6,7,4’-四甲氧基黄酮、甜橙黄酮、橘皮素、3,5,6,7,3’,4’-六甲氧基黄酮、川陈皮素、3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮、5-去甲基橘皮素、5-去甲基川陈皮素和5-羟基-3,6,7,8,3’,4’-六甲氧基黄酮的含量。每种黄酮分别以信噪比为3和10对应的多甲氧基黄酮标准品质量浓度计算检出限和定量限。

2 结果与分析

2.1 9 种多甲氧基黄酮标准品HPLC检测结果

图 2 9 种多甲氧基黄酮标准溶液HPLC图Fig. 2 HPLC separation of a mixture of nine PMFs standards

由图2可知，5-去甲基橘皮素在C18反相柱的保留时间比其相对应的多甲氧基黄酮更长，其原因可解释为由于5-位的羟基氢与4-位的羰基氧形成一个六圆环平面稳定的分子内氢键，而使得它们的极性减弱，在反相柱中表现出更强的亲脂性，因此保留时间较长。由图2可见，9 种多甲氧基黄酮均具有较好的峰形和分离度。

2.2 标准曲线的绘制结果

由表1可知，9 种多甲氧基黄酮在对照品溶液质量浓度范围内线性关系良好，线性相关系数r2不小于0.999 8。用已知质量浓度的纯品检测9 种工作曲线准确度，实际测得质量浓度与已知检测质量浓度都在±5%以内，说明在检测区间范围内有很好的检测准确度。日内检测和日间检测实验结果均证明在检测范围内（≤5%），这9 种多甲氧基黄酮工作区间线性关系很好，有很高的精确度。

表 1 9 种多甲氧基黄酮的标准曲线数据Table 1 Calibration equations, linear range and limits of detection and quantification for nine PMFs

2.3 柑橘果皮中9 种多甲氧基黄酮含量检测结果

图 3 广西皇帝柑果皮提取物HPLC图Fig. 3 HPLC profile of Emperor tangerine peel extract

由图3可知，广西皇帝柑果皮中川陈皮素和橘皮素含量均较高，但未检出3,5,6,7,3’,4’-六甲氧基黄酮和5,6,7,4’-四甲氧基黄酮。该方法较紫外分光光度计法、薄层色谱法更加准确，简便、快速。

从表2可知，不同品种及同一品种不同产地的柑橘果皮中的多甲氧基黄酮含量和种类有明显差异。在这14 种柑橘果皮样品中，金钱橘果皮中未检测到多甲氧基黄酮，柑橘果皮样品中多甲氧基黄酮总含量为998.95～10 412.18 µg/g，重庆柑橘、广西皇帝柑、广西沙糖橘和江西陈皮中多甲氧基黄酮总含量均较高，达到7 495.19 µg/g以上，其中广西沙糖橘多甲基黄酮总含量高达10 412.18 µg/g。果皮中多甲基黄酮总含量最少的品种是台州蜜橘（998.85 µg/g）。因此，建议除橙皮苷外，应该增加多甲氧基黄酮类成分作为陈皮的质控指标。

由表2可知，川陈皮素与橘皮素几乎是所有柑橘果皮中最常见且含量最高的多甲氧基黄酮，尤其体现在重庆柑橘、广西皇帝柑、广西沙糖橘、江西陈皮、蒲江美人橘和新会陈皮。近年来，随着其生物活性研究的愈加深入，对川陈皮素和橘皮素单品的需求量越来越大，因此选取最佳柑橘果皮品种及产地来源显得尤为重要。在本研究中，重庆柑橘、蒲江美人橘、广西沙糖橘、广西皇帝柑、新会陈皮、江西陈皮中川陈皮素含量相对较高（2 239.65～5 324.90 µg/g），其中广西沙糖橘果皮中川陈皮素含量最高达到5 324.90 µg/g；重庆柑橘、广西沙糖橘、广西皇帝柑、新会陈皮、江西陈皮中橘皮素含量较高（1 685.98～4 005.66 µg/g），其中广西沙糖橘果皮中橘皮素含量达到4 005.66 µg/g。所以，广西砂糖橘果皮可作为川陈皮素和橘皮素的最佳天然原材料，建议考虑将砂糖橘作为陈皮药材选材来源。而安远脐橙和赣南脐橙果皮中多甲氧基黄酮含量很低，据报道，脐橙中橙皮苷含量也较低[25,28]，所以脐橙不适合作为陈皮的制作原料。

去甲基多甲氧基黄酮是柑橘果皮中另外一种重要的黄酮化合物，以前研究表明，去甲基多甲氧基黄酮比多甲氧基黄酮有更强的抗肿瘤和抗炎活性[29-30]。在此研究中，重庆柑橘、浦江美人橘、江西陈皮和广西皇帝柑中5-去甲基川陈皮素总含量较高（384.99～637.61 µg/g），但仍然比其他非去甲基多甲氧基黄酮含量低很多。另外，5-去甲基橘皮素在所检测的所有品种柑橘果皮中含量均极低，大部分品种的柑橘果皮中都未检出5-去甲基橘皮素。因此，在天然柑橘果皮中去甲基多甲氧基黄酮含量偏低，新鲜柑橘皮经过长时间，例如3 a以上避光存放，由于微生物的作用，很可能产生更多比例或者不同种类的去甲基多甲氧基黄酮，加上挥发油的大量消失及糖苷健在酸性和微生物环境下断裂，使苷元、去甲基多甲氧基黄酮的含量成倍增长，因此大大增强陈皮的活性。而且，模仿陈皮陈化的研究工作已经开始并取得初步成效[31-32]，目的是快速、高效地研究橘皮多甲氧基黄酮有益健康的机理，并为开发功能食品提供数据支撑。

表 2 不同品种柑橘果皮中9 种多甲氧基黄酮总含量Table 2 Contents of six PMFs and three OHPMFs in different varieties of citrus peels μg/g

3 结 论

本研究以乙醇为溶剂，从14 种不同品种橘柑果皮中超声提取黄酮混合物，建立高效、高稳定性、并能够同时检测9 种主要多甲氧基黄酮HPLC分析方法，该方法较紫外-分光光度法等常见分析方法更准确、简便、快速，不需昂贵的液相色谱-质谱联用仪器，即可准确快速检测9 种或以上的多甲氧基黄酮。另外，此研究结果表明，柑橘果皮例如陈皮，作为药食两用选材等功能食品和药材，多甲氧基黄酮含量及其种类应该列为陈皮的质控指标，与生物活性建立定性定量的构效关系。