芪蓝四君子汤对雏鸡小肠IL-2和IFN-γ mRNA表达的影响

张殿新,吴 垠,宋臣锋,田启超,刘 冬,马奎红,钟秀会

(1.沧州职业技术学院畜牧兽医系,河北 沧州 061001；2.沧州市工贸学校经贸教学管理部,河北 沧州 061001；3.河北农业大学动物科技学院,河北 保定 071001)

近年来,许多学者应用医学、动物医学、免疫学及现代生物化学等领域里的新技术、新方法,进行了中药免疫增强剂的研究,并取得了一些研究成果[1-2]。其中现代分子免疫学研究认为,基因的转录产物mRNA是基因与表达产物间的桥梁,基因活化的直接结果是mRNA转录增加,而且蛋白的合成有赖于mRNA的翻译,因此特异性mRNA水平的变化可以较生物活性测定更准确地反应基因的活化状态[3]。大量研究表明,许多中药能够诱导并调节免疫细胞产生细胞因子,从而发挥强大的免疫调节和免疫激活作用[4-5]。因此,研究中药对细胞因子的基因表达对于阐明分子水平的免疫调节机制、以及免疫应答发生的机理等都是至关重要的,检测中药对细胞因子的诱生活性已成为评价中药对机体免疫调节作用的重要指标之一。

中药方剂四君子汤出自宋代太医局编著的《太平惠民和剂局方》,由人参 、白术 、茯苓、炙甘草四味中药组成,是中医扶正固本的经典名方,具有益气健脾之功效。近年来随着对四君子汤研究的深入,人们开始广泛关注其对机体的免疫调节功能 。笔者的前期试验证实,芪蓝四君子汤(四君子汤基础上增加黄芪和板蓝根)能增强雏鸡体液免疫及局部黏膜的免疫功能[6-7],本试验在前期的基础上采用半定量RT-PCR方法,测定了芪蓝四君子汤对雏鸡空肠中IL-2和IFN-γ mRNA丰度的影响,旨在从分子水平探讨芪蓝四君子汤的黏膜免疫增强作用和机制,为研制新型畜禽用免疫增强剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 中药方剂及药液制备 芪蓝四君子汤是在四君子汤的基础上进行加减而得,由党参(易人参)、黄芪、板蓝根、茯苓、白术、炙甘草六味中药组成,比例为3∶2∶2∶2∶2∶1,上述中药均购自北京同仁堂保定药店。按组方比例称取中药,放入容器内加水煎煮25 min～30 min,过滤取汁。然后再加水煎煮1次,将两次药液混合浓缩,使每毫升含生药1 g,高压灭菌后于4℃冰箱中保存备用[8]。临用时根据所需浓度进行稀释。

1.2 试验动物处理及样品采集 90只1日龄健康雏鸡(京白939雏鸡,购自沧州曹庄子鸡场)；随机分为5组,每组18只,常规饲养管理。14日龄进行首次免疫,Ⅰ ～Ⅳ组每只鸡经口腔免疫2羽份(106EID50/羽)鸡新城疫 LaSota系冻干苗[瑞普(保定)生物药业有限公司,批号：080519]0.5 mL,35日龄时重复免疫。Ⅰ～Ⅲ组,于免疫前2 d分别按0.125 g/mL、0.25 g/mL、0.5 g/mL 3 个浓度灌服芪蓝四君子汤1 mL,连续10 d。Ⅳ组和Ⅴ组灌服等量生理盐水。见表1。

表1 试验分组与用药

各组分别于20、40、60日龄,随机选取6只鸡剖杀,分别无菌采取相同部位肠管(空肠),用锡箔纸包好编号后放入液氮中速冻备用,在采集过程中做好防RNA酶污染的必要措施。

1.3 主要试剂 总RNA提取试剂盒(离心柱型DP419),dNTP、RNA酶抑制剂(RNasin)、反转录酶(M-MLV)、DNA 聚合酶(Taq)、DL-2 000 DNA Marker、Oligo(dT)18为保定天根生物试剂公司产品。

1.4 鸡IL-2、IFN-γ、β-actin基因引物设计与合成

参考GenBank上已发表序列,设计了用于同时扩增鸡的 IL-2(AF017645)、IFN-γ(NM_205149)、β-actin(L08165)基因的2对引物。并由宝生物工程(大连)有限公司合成,引物序列具体如下：

IL-2 上 游： 5′-TATCGAAAAGAACCTCAAG-3′；下 游： 5′-CCAGAATGGACAGCAGA-3′(245 bp)；IFN-γ 上游：5′-GCTGACGGTGGACCTATT-3′；下游：5′-CAAGTCGTTCATCGGGAG-3′(240 bp)； β-actin上游：5′-CATCTATCGTGGGTCGC-3′；下游：5′-CTCCTTGATGTCACGCAC-3′(547 bp)。

1.5 半定量RT-PCR方法的建立 所有进行RNA分离纯化的试管,枪头和电泳槽等均用DEPC处理过的水浸泡24 h以上,配置试剂时使用DEPC处理过的水。严格按照DP419试剂盒说明书提取总RNA,并计算RNA浓度,RT合成cDNA第一链。

1.5.1 IL-2、β-actin同管扩增指数期循环数和同管扩增引物比例的确定 用多个平行管,在同一PCR管中同时加入IL-2和β-actin引物,使IL-2、β-actin基因同管扩增,PCR循环参数为94℃5 min,94℃45 s,56℃45 s,72℃1 min,在不同循环圈数时取出一管放在4℃暂时保存,待所有的循环结束后再一起72℃延伸10 min,将产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,电泳结束于凝胶成像分析条带的净灰度。

将IL-2引物和β-actin引物进行适当稀释,将β-actin扩增限制在一定范围,但相对量不变,使扩增后的电泳条带净灰度与目的基因条带净灰度之比大约为1∶1。然后各取引物按照确定的循环数进行PCR,产物行1%琼脂糖凝胶电泳,并分析条带的净灰度。

1.5.2 IFN-γ、β-actin同管扩增指数期循环数及扩增引物比例的确定 IFN-γ、β-actin同管扩增指数期循环数及扩增引物比例的确定方法同上。

1.6 试验样本的检测与灰度分析 试验样本的总RNA提取和RT-PCR测定按照1.5建立的半定量RT-PCR方法(循环数,引物比)进行检测,每样本扩增3管。取PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳。用TotalLab V2.01软件进行灰度分析和图像处理。按下式计算基因的mRNA表达的相对含量：IL-2或IFN-γ基因相对表达值=IL-2或IFN-γ基因条带灰度值/β-actin基因条带灰度值,作为 IL-2或 IFN-γ基因表达水平的指标。

1.7 数据统计 所有数据,采用SPSS13.0统计软件对各项数据进行One Way ANOVA分析。以P＜0.01(差异极显著),P＜0.05(差异显著)作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 IL-2、β-actin同管扩增循环数摸索结果 电泳结果如图1所示,当PCR进行到25个循环时二者都出现了条带,β-actin清晰,IL-2仍然很弱。但到34个循环时扩增开始出现非特异条带。所以,为了保证试验样本在指数期内测定,选择31个循环为本试验检测IL-2时PCR扩增的循环数。

图1 IL-2、β-actin同管扩增循环数摸索结果的电泳图

2.2 IL-2、β-actin基因同管扩增引物比例摸索结果 随着β-actin引物量与目的基因IL-2引物比例的调整,到IL-2/β-actin引物浓度为7∶1时,两种基因扩增效率相近,条带净灰度比值约为1∶1。因此,IL-2与β-actin的引物比例选择为7∶1。见图2。

图2 IL-2、β-actin基因同管扩增引物比例摸索结果的电泳图

2.3 IFN-γ、β-actin同管扩增循环数摸索结果 电泳结果如图3所示,在27个循环后,IFN-γ和β-actin mRNA出现梯度变化,到第35个循环时扩增条带清晰,所以选择35个循环为本试验检测IFN-γ时PCR扩增的循环数。

2.4 IFN-γ、β-actin基因同管扩增引物比例摸索结果 将β-actin引物与IFN-γ基因引物放在一起扩增,随着β-actin引物量的递减,条带也越来越淡,当IFN-γ/β-actin引物浓度比为5∶1 时,二者 β-actin 条带灰度与条带灰度大约为1∶1。见图4。

图4 IFN-γ、β-actin基因同管扩增引物比例摸索结果的电泳图

2.5 芪蓝四君子汤对雏鸡小肠IL-2 mRNA表达的影响 在整个试验过程中,芪蓝四君子汤组IL-2 mRNA表达量普遍高于免疫对照组,其中20日龄时,芪蓝四君子汤各剂量组丰度与免疫对照组相比均差异极显著(P＜0.01)；在40日龄时,中,低剂量芪蓝四君子汤可显著提高小肠IL-2 mRNA丰度(P＜0.05)；到60日龄时,3个剂量组芪蓝四君子汤均极显著高于免疫对照组(P＜0.01)。见图 5、6。

图5 芪蓝四君子汤对IL-2mRNA表达丰度变化的电泳图

2.6 芪蓝四君子汤对雏鸡小肠IFN-γ mRNA表达的影响 在试验初期20日龄时,空肠中IFN-γ mRNA的丰度最高,40、60日龄时依次逐渐下降。其中20日龄时,高剂量组IFN-γ mRNA表达量与单独新城疫免疫组相比差异极显著(P＜0.01),同时中剂量组可显著提高IFN-γ mRNA的丰度(P＜0.05)；40日龄时,只有中剂量组可显著提高IFN-γ mRNA的丰度(P＜0.05),其余各组差异不显著。见图7、图8。

图6 空肠内IL-2 mRNA相对表达值

图7 芪蓝四君子汤对IFN-γ mRNA表达丰度变化的电泳图

3 讨论

图8 空肠内IFN-γ mRNA相对表达值

大量报告显示,中药以及成分不仅能通过影响免疫细胞的功能而发挥其免疫调节作用,也能通过调细胞因子的表达、分泌从分子水平作用于机体的免疫系统。其中储岳峰[9]等报道黄芪多糖、淫羊藿多糖、蜂胶黄酮等均能在体内或体外促进 ConA诱导的 T淋巴细胞产生IL-2；Che-Ming Hung[10]等报道,口服银翘散能显著提高ConA诱导的T淋巴细胞产生IL-2和INF-γ。以上这些研究主要集中在外周血淋巴细胞和单核细胞受刺激后短时间内其细胞因子mRNA表达水平的变化。而本试验与此不同,直接提取了组织(空肠)中mRNA,检测雏鸡口服芪蓝四君子汤后不同日龄肠道中Th1型细胞因子的变化,从而更灵敏,更直接的反应了雏鸡口服芪蓝四君子汤后的局部免疫状态。本试验选择表达稳定的β-actin作为内标与细胞因子引物同时扩增,用来校正不同样本之间的差别。试验中笔者通过调整两对引物之间的比例来限制内标的过度扩增,而且试验中发现目的条带净灰度并没有因为β-actin引物的变化而出现竞争性梯度变化,说明内标和目的条带之间没有发生干扰,半定量RT-PCR测定雏鸡小肠细胞因子mRNA丰度的方法建立。

当前,国内外对鸡IL-2的研究表明,IL-2是引起T细胞增殖的主要细胞因子,对一般的免疫应答起到良好调节作用[11]。它具有促进T、B淋巴细胞的增殖和分化,增强单核细胞以及NK细胞的杀伤活性等免疫调节功能。IL-2的这种免疫调节功能,还表现在能够增强疫苗诱导的免疫反应,诱导机体产生细胞免疫,非特异增强机体体液免疫,从而全面提高机体免疫功能。因此,对小肠中IL-2 mRNA进行检测能直接反映雏鸡肠道的免疫功能。本试验结果表明,芪蓝四君子汤配合新城疫弱毒疫苗使用,能显著提高雏鸡小肠中IL-2 mRNA的丰度,增强雏鸡肠黏膜的免疫功能,对雏鸡肠道起到良好的保护作用。

IFN-γ是Th1细胞分泌的一种具有特征性的细胞因子,在调节机体免疫应答、抗肿瘤细胞增殖和抗病毒中具有重要作用[12]。此外IFN-γ对MHC II成熟以及抗原呈递等有明显促进作用[13],因此也是衡量机体细胞免疫水平的一个重要标志[14]。本试验以鸡新城疫弱毒疫苗免疫鸡后,到20日龄时(即免疫后第6天),所有免疫组IFN-γ mRNA的表达量显著高于非免疫对照组,这与Yun[14]及王赛[15]的结果相似。说明口服新城疫弱毒疫苗后,抗原可以直接刺激肠道淋巴细胞,使其激活、增殖最终摆脱IFN-γ抑制状态、使其获得表达。在试验前期芪蓝四君子汤对IFN-γ mRNA的丰度有明显的增强作用,且在一定范围内药效与用药量呈现正相关关系。而到试验后期芪蓝四君子汤各组IFN-γ的表达水平较低。推测IFN-γ mRNA可能在免疫初期表达较多,随后迅速转录为蛋白质形式发挥作用,因而造成后期IFN-γ mRNA表达不显著。

总之,本试验以IL-2和IFN-γ mRNA表达水平为指标,探索了该中药复方增强免疫的分子机理,由试验结果来看,芪蓝四君子汤的免疫增强作用与其在转录水平上促进Th1型细胞因子的表达有关。提示这可能是芪蓝四君子汤增强机体免疫力和发挥免疫增强作用的重要机制之一,但是细胞因子基因的转录和表达受到多种因素的综合调控,并且细胞因子之间作用效果、作用途径也不尽相同。因此对芪蓝四君子汤的免疫机理的探索还应该与其他免疫效应如免疫细胞活性指标联合,综合分析,这为下一步的工作提供了重要启示。