产气荚膜梭菌α毒素C末端的二拷贝串联表达与免疫原性分析

杜吉革,王 磊,薛 麒,朱 真,李启红,印春生,姚文生,康 凯,陈小云

(中国兽医药品监察所,北京 海淀 100081)

产气荚膜梭菌能引起人类以及多种家畜家禽发病,不仅威胁着人类的健康,而且对畜牧业造成了巨大的经济损失。根据4种主要致死性外毒素α(CPA)、β(CPB)、ε(ETX)和 ι(CPI),可将该菌分为A、B、C、D、E 5 个毒素型[1]。 其中,对养牛业危害最大的是A、C型和D型。在国外,牛的产气荚膜梭菌病主要由C、D型菌引起,而在国内,牛的产气荚膜梭菌病的病原主要是A型菌[8],病牛往往无任何前驱症状,而突然发病死亡[2-3]。为此,疫苗免疫是防制该病的有效手段。然而国内还没有商品化的疫苗,虽然灭活疫苗在预防羊的产气荚膜梭菌上,起到了一定的效果,但该类疫苗的制备过程冗杂,抗原成分复杂,有效抗原量较低。如大剂量的肌肉注射会破坏牛肉的品质。因此,提供安全、纯净、有效的抗原对未来预防该菌感染具有重要意义。

CPA是由产气荚膜梭菌染色体基因 plc编码[4],在A型毒株中表达水平最高[5]。成熟的CPA分为N-末端(1-246,CPAN)和 C-末端(247-370,CPAC)两个结构域。其中,CPAN是CPA发挥酶活性的主要区域,而CPAC是毒素与细胞结合的主要区域[6]。研究表明,重组 CPA仍存在一定的毒力[7],而通过甲醛灭活后的CPA抗原性会明显降低[8-10]。为此,无毒力的重组CPA的研制具有重要的意义。已有的研究表明,无毒力的CPAC能够对天然CPA起到一定的免疫保护作用[11-15]。然而,由于CPAC蛋白分子量较小,研究者通常选择将CPAC与GST等大分子量标签蛋白融合表达,从而引入了无关的抗原成分。为了更好发挥CPAC对天然CPA的抗原保护作用,本研究根据现行A型产气荚膜梭菌标准株(C57-1株)CPAC的编码序列,按大肠杆菌偏爱的密码子进行优化设计,并将CPAC进行二次重复,经原核系统表达、纯化和鉴定,并对重组蛋白的免疫保护性进行研究。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒、实验动物和试剂 A型产气荚膜梭菌C57-1株、C57-1株天然毒素、C57-1毒素抗血清及pET-30a(+)(以下简称pET)均为本实验室保存；1.5～2.0 kg普通级健康日本大耳白兔和体重16～18 g ICR小鼠,购自北京维通利华实验动物技术有限公司；感受态细胞,购自北京全式金生物科技有限公司；佐剂Montanide ISA 201,购自法国Seepic公司；蛋白 Marker(M1)、Western Blot Marker(M2)、Ni-IDA亲和层析介质试剂盒,购自金斯瑞生物科技有限公司；高保真PCR酶KOD,购自东洋坊；Premix taq version 2.0,购自 TaKaRa公司。T4 DNA连接酶、DNA凝胶回收试剂盒,购自Promaga公司；限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ,购自NEB公司；抗His标签单抗、Bradford蛋白浓度测定试剂盒,购自碧云天生物技术有限公司。

1.2 基因合成及密码子优化 以C57-1的CPAC(GenBank号：AY823400.1)基因为模版,按大肠杆菌偏爱密码子进行优化设计并二次重复,片段之间用氨基酸GGGS连接。同时,在基因C末端添加6×His标签蛋白的编码区,人工合成GCPAC2。

1.3 原核表达载体的构建 以GCPAC2为模板,采用引物对1F/1R进行PCR扩增。其中上游引物1F序列为：5′-GGCGGATCCGTTGGTAAGAAC-3′,其 5′端引入限制性内切酶BamHⅠ位点(下划线部分)；下游引物1R序列为：5′-GGCCTCGAGTTAGTGGTGATGGT,其5′端引入限制性内切酶XhoⅠ位点(下划线部分)。PCR体系为50 μL,反应条件为：94℃预变性4 min；98℃变性10 s,56℃退火30 s,68℃延伸90 s,共33个循环；最后68℃延伸7 min。

回收DNA条带,采用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,与pET连接。将连接好的质粒转化Top10感受态细胞,挑取单克隆,37℃振荡培养过夜后,提取质粒。对所提质粒进行PCR鉴定后送测序,将测序正确的质粒命名为pCPAC2。

1.4 重组蛋白的表达与纯化 将pCPAC2以及pET转化至BL21感受态细胞中,分别在15℃和37℃条件下用IPTG诱导表达,并检测重组蛋白的表达情况及其可溶性以及与以抗His抗体的反应性。包涵体采用洗涤液洗涤后,以缓冲液溶解。平衡Ni-IDA柱后,与可溶蛋白孵育,最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白,并收集每个洗脱组分检测。收集纯度较高的洗液,用透析袋进行透析和复性后,上清用0.22μm滤器过滤分装,最终得到重组蛋白rCPAC2。最后测定蛋白浓度后保存于-80℃备用。

1.5 rCPAC2与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应 以A型产气荚膜梭菌毒素抗血清为一抗,HRP标记的山羊抗兔IgG二抗,检测rCPAC2与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应。

1.6 抗原性分析

1.6.1 免疫程序 将rCPAC2与Montanide ISA 201佐剂以1∶1(v/v)的比例配制成终浓度为50 μg/mL的疫苗,另取灭菌PBS与Montanide ISA 201佐剂以1∶1(v/v)的比例制备对照疫苗,置4℃保存备用。选用体重1.5～2.0 kg健康家兔,取8只对A型产气荚膜梭菌毒素的中和效价为0的家兔,其中4只颈部皮下注射疫苗,2.0 mL/只,免疫后14 d,以相同剂量、相同途径进行二免。另外4只以免疫对照疫苗。

1.6.2 血清中和效价测定 分别在一免后14 d以及二免后21 d,对试验组及对照组所有家兔经耳缘静脉采血,分离血清备用。按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)三部中规定的方法测定血清中和效价[16]。

1.6.3 攻毒试验 二免后21 d,通过耳缘静脉各注射1个家兔MLD剂量的A型产气荚膜梭菌毒素,观察5 d,记录家兔的死亡情况,判定试验疫苗的免疫保护效力。

2 结果

2.1 CPAC2串联基因的原核表达载体的成功构建获得的重组质粒酶切后出现大小约5 kb的载体DNA片段,以及大小约765 bp的基因片段,与预期相符。测序结果表明,插入的外源基因序列正确,将此质粒命名为pCPAC2。

2.2 CPAC2串联基因的原核表达与纯化 将pCPAC2以及pET转化BL21并诱导表达。结果显示,在15℃诱导16 h和37℃诱导4 h两种条件下重组蛋白的表达形式均以包涵体为主,且能与抗His抗体发生反应,分子量约为40 kDa,大小与预期相符(图1)。综合考虑蛋白表达量和诱导时间,选择37℃诱导4 h的诱导条件。如图2所示,收集纯度较高的Lane7～9洗脱液进行透析和复性,最终获得了的蛋白rCPAC2浓度为0.771 mg/mL。

图1 rCPAC2的原核表达与鉴定

图2 rCPAC2的纯化

2.3 rCPAC2与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清的鉴定 结果如图3所示,rCPAC2与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清发生反应。

2.4 rCPAC2的免疫原性分析

2.4.1 抗rCPAC2兔血清的毒素中和抗体效价测定经血清中和法测定,以rCPAC2免疫兔子后,每毫升的一免和二免抗血清分别可中和30个小鼠和80个小鼠MLD的A型产气荚膜梭菌梭菌毒素。

图3 rCPAC2与A型产气荚膜梭菌抗毒素血清的反应

2.4.2 rCPAC2免疫对兔的免疫保护结果 在第2次免疫后21 d,耳缘静脉注射1 MLD剂量的A型产气荚膜梭菌天然毒素进行攻毒,结果发现,对照的家兔在5 d内全部死亡,rCPAC2免疫组的家兔在5 d内全部键活。

3 讨论

随着研究的深入,与产气荚膜梭菌密切相关的主要致死性外毒素的结构和致病机理越来越清晰,致死性外毒素的部分无毒区域(CPA[11-13]、CPB以及CPI的C末端[17])或者无毒突变体(ETX)[18]和θ毒素(PFO)[19]作为亚单位疫苗抗原已经被证实能够有效地中和相应的毒血症。作为A型产气荚膜梭菌的主要致死性毒素,CPA的减毒乃至无毒研究工作成为了众多研究者的方向。虽然对CPA发挥功能的关键氨基酸位点进行单点突变能够实现减毒的目的[20],但这些突变体的免疫原性还没有得到充分的研究。此外,单个氨基酸突变的CPA在未来基因工程疫苗大规模生产中存在一定的生物安全隐患。已有研究表明,CPA分子主要由CPAN和CPAC构成。其中,具有细胞毒性的CPAN是CPA酶活性的中心,而无细胞毒性的CPAC主要发挥着与细胞受体相结合的功能。对CPA的两个区域免疫保护性分析的结果表明,单独的CPAC具有一定的免疫保护作用,而单独的CPAN却无免疫保护作用。然而,由于单独的CPAC分子量过小,需要与GST等标签蛋白串联表达,从而造成CPAC实际的抗原量不足,而且对难以对该蛋白的免疫保护性进行准确定量。为此,本研究将CPAC进行2次重复后进行串联表达,不仅增加了有效抗原量,也增加抗原蛋白整体的分子量,更有利于增强分子的抗原性。

本研究发现在15℃的条件下诱导16 h后,rCPAC2可溶性表达比例可达15%,明显高于37℃条件下。但综合考虑蛋白表达量和诱导时间,我们选择选择37℃诱导4 h。试验结果证明以非可溶形式表达的rCPAC2经纯化复性后具有较好的免疫原性。在实际生产中,以包涵体形式表达的重组蛋白在纯化中可显著产物中内毒素的含量。然而,在前期的研究中我们发现可溶性重组ETX免疫原性明显高于非可溶性的重组蛋白。为此,探讨如何提高rCPAC2的可溶性表达及其免疫原具有重要意义。