山羊布鲁氏菌病不同血清学检测方法的比较

陈关雄，倖华林，鲁丽芝，高丽艳，赵 富，李琼仙，杨朝晖，李瑞远

（石林彝族自治县畜牧兽医总站，云南石林 652200）

布鲁氏菌病（以下简称布病）是由布鲁氏菌引起的一种人兽共患病。布鲁氏菌分为12个种[1]，其中牛种、猪种、羊种、犬种对人类致病，但致病力存在差异，羊种致病力最强[2]。人感染布鲁氏菌后临床表现较为复杂，可表现骨关节、肝、脾、心脏等多个脏器受损[3]。2005—2016年，从全国人布鲁氏菌病病例中分离出276株布鲁氏菌，其中羊种占74%[4]。随着人们生活水平的提高及饮食结构的转变，山羊产业得到迅速发展，使得山羊布鲁氏菌感染率逐年上升，给人类健康和畜牧业安全生产带来了严重危害。

家畜感染布鲁氏菌后最常出现的临床症状是流产[5]。但仅靠临床症状来诊断较为困难，需进行实验室检测才能确诊。实验室诊断方法主要分为两类：一类是通过病原分离鉴定或聚合酶链反应试验（PCR）等方法诊断，另一类是通过血清学检测方法诊断。布鲁氏菌血清学检测方法具有操作简单、快速、特异性高等特点，在未免疫布鲁氏菌疫苗的地区最为常用。布鲁氏菌血清学检测方法主要有虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（SAT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和补体结合试验（CFT）等[6]。本研究通过RBT、SAT和竞争酶联免疫吸附试验（cELISA）对采集的山羊血清进行抗体检测，比较不同血清学检测方法的一致性、敏感性和特异性，为今后开展山羊布病监测与净化，选择使用适当检测方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物血清 石林县辖区范围内的散养户山羊423只，颈静脉采集血液，分离血清后冷冻保存。

1.1.2 诊断试剂 RBT试验抗原、标准阳性和阴性血清：购自中国兽医药品监察所；SAT试验抗原、标准阳性和阴性血清：购自哈药集团生物疫苗有限公司；布鲁氏菌ELISA试剂盒：购自上海快灵生物科技有限公司。

1.1.3 主要仪器设备 酶标仪：美国宝特公司产品，型号ELX-800；恒温培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品，型号GSP-9080MBE；移液器：德国Epprndorf公司产品；电动离心机：上海安亭科学离仪器厂产品，型号TDL-80-28。

1.2 方法

1.2.1 操作与判定 RBT和SAT方法，按照国家标准《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T 18646—2018）进行操作与判定；cELISA方法，按照试剂盒提供的操作说明书进行操作与结果判定。

1.2.2 数据分析 对检测结果用SPSS 20软件进行χ2检验，统计分析不同检测方法的差异性。

2 结果

2.1 不同方法检测情况

423份羊血清中，采用RBT检测，阳性检出率为13.00%（55/423），SAT阳性检出率为12.06%（51/423），cELISA的检出率为11.35%（48/423）。具体检测结果见表1。

表1 不同方法的检测结果

2.2 不同检测方法结果比较

2.2.1 SAT与RBT 55份RBT阳性血清中，有51份SAT阳性血清、4份阴性血清，368份RBT阴性血清SAT检测全为阴性，SAT与RBT的符合率为99.05%（表2）。利用SPSS 20软件，对RBT和SAT两种方法的检测结果进行统计学分析，Kappa值＝0.957，P＝0.125＞0.05，差异不显著。

表2 SAT与RBT检测结果比较

2.2.2 cELISA与RBT 55份RBT阳性血清中，有48份cELISA 阳性血清、7份阴性血清，368份RBT阴性血清cELISA检测全为阴性，cELISA与RBT的符合率为98.35%（表3）。利用SPSS 20软件，对RBT和cELISA两种方法的检测结果进行统计学分析，Kappa值＝0.923，P＝0.016＜0.05，差异显著。

表3 cELISA试验与RBT检测结果比较

2.2.3 cELISA与SAT 51份SAT阳性血清中，有45份cELISA阳性血清、6份阴性血清，372份SAT阴性血清中，有369份cELISA阴性、3份cELISA阳性，cELISA与SAT的符合率为97.87%（表4）。利用SPSS 20软件，对RBT和cELISA两种方法的检测结果进行统计学分析，Kappa值＝0.897，P＝0.508＞0.05，差异不显著。

表4 cELISA和SAT检测结果比较

2.3 不同检测方法相关性比较

423份血清通过3种检测方法检测，全部为阳性的45份，全部为阴性的368份。根据敏感性和特异性计算公式计算，RBT敏感性为100%，特异性为97.35%；SAT敏感性为91.84%，特异性为98.40%；cELISA敏感性为86.54%，特异性为99.19%（表5）。

表5 3种检测方法相关性比较

3 讨论

我国家畜布病诊断方法主要是参照国家标准GBT18646—2018，首先用RBT或全乳沉淀试验初筛，之后再用SAT或CFT进行复检，而OIE则选用cELISA和CFT进行确认[7]。

RBT敏感性较高、操作简便、耗时短、成本低[8]，但在检测过程中容易受到血清严重溶血、交叉反应或抗原抗体反应超过4 min后出现纤维素的凝集块，而出现假阳性[9]。通过本实验研究，RBT阳性检出率均高于SAT和cELISA，因此，还需要采用其它检测方法进行验证与确诊。

SAT检测免疫球蛋白M（IgM）敏感性较高，可作为布病早期诊断；同时，可用于人畜布鲁氏菌菌苗免疫后的机体最早血清学抗体的检测。此法优点是判定容易，具有较高的诊断价值[10]。SAT在检测过程中较繁杂，判定过程所需时间较长，结果的判定易受主观因素的影响而出现较大的误差，单独应用会造成误诊和漏诊，因而不是对所有感染动物抗体水平都具有诊断意义[11]。通过本实验研究，使用SAT方法检测山羊布病抗体，阳性抗体的检出率低于RBT，且有可疑的情况存在，经间隔一个月后再采血检测，可疑山羊全部为阳性，同时，SAT检测所需时间较长，需配合其它检测方法开展检测，以提高工作效率。

cELISA敏感性、特异性非常高，是大多数哺乳动物布病检测的一种很好的确诊性试验，出现假阳性和假阴性的概率都比较低[12]，一次可以完成大量样本的检测，不仅应用于血清抗体的检测，还可用于乳样抗体的检测[13]。通过本试验研究，采用cELISA方法检测布病，对RBT和SAT出现假阳性的情况，cELISA也能准确地鉴别出来，说明cELISA的特异性较高。本试验通过对423份山羊血清检测，发现有5份SAT可疑的血清样品，采用cELISA方法检测均呈阳性，和使用SAT方法间隔一个月后再重新采血检测的结果一致。

本试验通过RBT、SAT和cELISA的对比检测发现，布病血清抗体检测时只使用某种检测方法很难对待检血清做出快速、准确地判断。本试验对3种检测方法的结果进行比较，3者的符合率较高。在布病监测净化过程中，往往需要大规模对样品进行检测，为了提高检测的速度，降低工作量和检测费用支出，可采用灵敏性较高，操作简便、价格低廉的检测方法进行初步筛选，再选用灵敏性和特异性都较高的方法进行复核和确诊。通过研究认为，在开展布病检测净化时可选用RBT进行初筛，初筛阳性的血清可用SAT进行复核，对于复核可疑的情况用cELISA进行确诊，或RBT初筛阳性的血清直接用cELISA进行确诊，这样不仅大大降低了检测成本，更缩短了检测时间，便于大规模地开展监测检验工作。