鉴定病死畜禽产品四种理化方法的有效性和适用性研究

刘 娜，高玉斌，赵建梅，马 冬，颜世敢，张卫国，曲志娜，王 娟，王君玮，赵 格

（1. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2. 青岛易邦生物工程有限公司，山东青岛 266032；3. 齐鲁工业大学生物工程学院，山东济南 250353；4. 山西省文水县农业委员会，山西文水 032100）

随着生活水平的提高，人们对畜禽产品质量安全的要求也越来越高。我国2015年新颁布的《食品安全法》第三十条规定，禁止生产经营病死、毒死或者死因不明的禽、畜、兽、水产动物肉类及其产品；新修订的《动物防疫法》第二十五条规定，禁止屠宰、经营、运输和生产、加工、贮藏病死或者死因不明的动物及其产品。但仍有少数不法商贩，受利益驱使，无视群众健康和法律法规，屠宰和经营病死动物及其产品，不仅影响动物疫病防控，而且影响动物产品消费安全。因此，加快病死动物产品快速鉴定技术研究，可为基层动物卫生监督工作提供有效的技术支撑，从而确保人们的饮食安全。

目前对死亡畜禽及其产品的检验检疫主要依赖于样品感官性状和病理变化的感官检查，较为主观。此外，有学者提出利用肉汤浸出液的pH、过氧化物酶、硫酸铜沉淀以及微生物毒素等鉴定死亡畜禽及其产品[1-4]。但是，这些理化方法的研究并不系统，有些只针对其中一种理化方法或只关注肉品的新鲜度[5-6]，而有些只针对死亡猪肉[7]，有的无法真实反映对病死畜禽样品鉴定的有效性[8]。因此，本研究采集了死亡和健康猪肉和鸡肉样品，对pH试纸法、硫酸铜沉淀法、过氧化物酶法以及微生物毒素法进行鉴定的有效性和适用性进行了较为系统的研究。

1 材料与方法

1.1 样品收集

试验中所使用的115份死亡猪肉采集自山东省胶州市病害动物无害化处理厂、济南市周边养殖场以及攻毒致死的猪只（含确诊为细菌感染的22头、病毒感染的15头），85份死亡鸡肉来源于青岛易邦生物工程有限公司的死亡鸡只（含确诊为细菌感染的24只、病毒感染的17只）；86份健康猪肉来源于青岛万福集团有限公司正常屠宰的健康猪，40份健康鸡肉来源于青岛田润食品有限公司正常屠宰的健康肉鸡。样品采集时剖开表皮进行多个位点的肌肉采样，样品采集后均独立放于无菌塑封袋中，低温下当天送至实验室进行理化方法的有效性检测；分别存放4 ℃冷藏3 d以及-20 ℃条件7 d和30 d取出进行理化方法的适用性检测。

1.2 pH试纸法

称取样品肌肉1 g放入匀质袋内，并加入蒸馏水3 mL。经匀质后，置于10 mL离心管中浸泡15 min，期间振摇数次，静置分层，上层即为1∶3肉浸液。取肉浸液滴于pH（5.4～7.0）精密试纸条一端，数秒后与标准比色板比较，直接读取pH近似数。pH大于5.75为死亡动物肉品，阳性（＋），pH小于5.5为阴性（-）。

1.3 过氧化物酶法

自采样肉品切取片状肌肉（3 cm×2 cm ×0.5 cm）1块，新鲜切面朝上平置于培养皿中。在肉片上滴加5滴0.2%联苯胺乙醇溶液、2滴1%过氧化氢溶液，3 min内观察颜色变化。被检肉片不出现蓝色为阳性（＋），即为死亡动物肉品，被检肉片出现蓝色为阴性（-）。

1.4 硫酸铜沉淀法

称取样品肌肉1 g放入匀质袋内，加蒸馏水3 mL，匀质后置于10 mL试管中，沸水浴10 min；取上清液，加入到2 mL离心管中，10 000 r/min离心1 min，即为1∶3提取液。取一支新试管加入2 mL离心所得上清液和5滴5%硫酸铜溶液混匀、静置，1 min内观察反应，读取结果。同时设定已知健康动物肉品的阴性对照管和蒸馏水的空白对照管。试管内出现明显浑浊或胶冻状为阳性（＋），即为死亡动物肉品，试管内澄清透明为阴性（-），空白对照管内液体颜色不发生变化。

1.5 微生物毒素法

称取样品肌肉2 g放入匀质袋内，加入灭菌生理盐水4 mL、4%氢氧化钠溶液2滴，匀质后置于10 mL离心管中，沸水浴10 min；取出冷却，滴加1滴5%草酸溶液并混匀；取上清液，加入到2 mL离心管中，10 000 r/min离心1 min，即为1∶2提取液，待检。取一支新试管加入待检样品提取液2 mL（避免吸入肉糜），滴加1滴1%甲酚蓝乙醇溶液、3滴0.5%硝酸银溶液、1滴40%盐酸溶液，振摇混均；再滴加2～3滴1%高锰酸钾溶液，振摇混均，3 min内观察颜色变化。同时做健康动物肉品提取液的阴性对照管和灭菌生理盐水的空白对照管。试管内肉品提取液显蓝色、蓝绿色或蓝紫色为阳性（＋），即为死亡动物肉品，试管内提取液显红紫色、浅褐色、灰白色或红褐色为阴性（-），空白对照管内液体颜色不发生变化。

2 结果

2.1 有效性验证

用4种理化方法检测所采集的病死畜禽和健康畜禽样本，结果如表1所示。pH试纸法、过氧化物酶法和硫酸铜沉淀法可以有效鉴别死亡猪肉和健康猪肉样本，对病死猪肉的阳性检出率分别为76.3%、58.3%和68.7%；对于鸡肉样本，pH试纸法和过氧化物酶法的有效鉴别效果较差，硫酸铜沉淀法对病死鸡肉样本的鉴别有效性尚可（阳性检出率为81.2%）。微生物毒素法对健康猪肉中的毒素检出率较高（达67.4%），接近于病死猪肉72.2%的阳性检出率。

由表2可知，硫酸铜沉淀法检测病死畜禽的敏感性和特异性均较高，准确度也是4种方法中最高的（81.4%）；其次是过氧化物酶法，特异性较高，但是敏感性一般；pH试纸法特异性较高，而敏感性过低，而微生物毒素法则敏感性较高，特异性过低。

2.2 适用性验证

将于采样当天、冷藏3 d以及冷冻7 d和30 d的死亡畜禽和健康畜禽样本，用4种理化方法检测，验证不同贮存条件下、不同时间内检测方法的适用性。总体上，pH试纸法对病死畜禽和健康畜禽样本的检出率随贮藏时间的增加而升高，对病死猪肉各时间段的检出率较高，而对健康猪肉的检出率均不高，表明该方法对鉴别病死或健康猪肉的适用性较好（图1）。过氧化物酶法对病死和健康猪肉样本的检出率随时间变化不明显，但对病死鸡肉样本死亡当天的效果较好，对其余时间的健康鸡肉也存在较高的阳性反应，表明该方法对鉴别病死或健康猪肉，以及病死或当天健康鸡肉的适用性较好（图2）。硫酸铜沉淀法对病死动物样本的检出率随时间变化不明显，只对冷冻超过7 d健康动物样本有一定的阳性反应，表明该方法对鉴别7 d以内的病死或健康畜禽肉的适用性较好（图3）。微生物毒素法对不同时间病死畜禽样本的检测无规律可言，总体不适用于鉴别不同贮存温度和时间的病死或健康畜禽样本（图4）。

表1 4种理化方法对健康或病死猪肉和鸡肉样本的阳性检出情况

表2 4种理化方法对病死畜禽样本鉴定的有效性评价

图1 pH试纸法检测的适用性

图2 过氧化物酶法检测的适用性

图3 硫酸铜沉淀法检测的适用性

图4 微生物毒素法检测的适用性

2.3 对不同病原致死畜禽样本检测的适用性

通过验证不同贮存温度和时间情况下4种理化方法对病死动物样本检测的适用性，发现pH试纸法、过氧化物酶法、硫酸铜沉淀法的适用性较好。为进一步验证此3种方法对不同病原致死的畜禽样本检测的适用性，利用已经临床和实验室确诊病因（包括病毒和细菌感染）的猪和鸡样本展开试验，结果发现：pH试纸法和硫酸铜沉淀法对病毒感染致死猪肉样本的检出率达100%，对细菌感染猪肉样本检出率在60%左右，过氧化物酶法对病毒和细菌感染的猪肉检出率均为60%左右；硫酸铜沉淀法对细菌或病毒感染致死的鸡肉样本检出率均较高，而过氧化物酶法对细菌感染的鸡肉有一定的适用性，对病毒感染的鸡肉适用性较差，而pH试纸法总体不适用于病死鸡肉样本的鉴定。

表3 3种理化方法对不同病原感染畜禽样本的阳性检出率单位：%

3 讨论

肉品健康度反映了宰前畜禽的健康状况，也直接决定了宰后畜禽产品的新鲜度，是监管部门最重视的畜禽产品质量安全指标之一。但由于目前尚没有系统的实验室检测方法可以参考，肉品健康度的检测主要依靠检验人员的经验进行感官检查。本研究利用不同畜禽种类、不同储存温度和时间、不同类型致死病原的病死畜禽样本，对文献中综述或研究的4种理化方法进行了有效性和适用性确证。

截至目前，国内已存在较多利用理化方法鉴定病死畜禽产品的研究报道，但最终结论并不完全统一。多数研究认为硫酸铜沉淀法可用于鉴别健康畜禽和病死畜禽样本[7，9-13]，鉴别率高至90%以上。本研究结果也显示，硫酸铜沉淀法可用于鉴别病死畜禽产品，但是鉴别率并未达到90%。硫酸铜沉淀法的主要原理为，铜离子可与死亡畜禽组织内的蛋白或蛋白降解产生的带有负电荷的多肽发生反应，形成难溶于水的蛋白盐。实际上畜禽肉的pH是一定的，但不同蛋白的等电点不同，那么等电点低于畜禽肉pH的蛋白即带负电，而这少量带负电蛋白也会与铜离子发生盐析反应。正如文献报道，正常的畜禽组织内也会有少量带有负电荷的蛋白，硫酸铜沉淀也可以在健康肉浸出液中发生[14-15]。本研究也发现，健康畜禽肉会有少量硫酸铜沉淀析出，只是析出时间比病死畜禽肉稍长，原因可能是部分病死畜禽肉的蛋白降解，使带负电荷的片段增多，所以本实验将沉淀观察时间缩短至1 min，这样就能有效鉴别病死畜禽。但需注意的是，冷冻7 d及以上时间的健康动物样品也有一定的阳性反应（0～15%），而细菌感染的猪肉样品阳性检出率稍低（63.6%），可能与已确诊细菌感染的样品量较低有关。

虽然微生物毒素检测病死畜禽样品理论上可行，但是实际操作中发现，健康畜禽样品也经常能检出微生物毒素阳性，且与不同储存温度和时间无相关性，原因可能为健康肉品其实也暴露于微生物的污染之中。因此，即使保证采样后无菌操作，前期屠宰销售过程中的暴露也使肉品有了一定程度的微生物污染，所以认为此法不能用于鉴定病死畜禽，这与之前的文献报道一致[9，12，16]。

宰后肉品的pH有5个变化阶段，即肉品酵解、僵直、成熟、自溶和腐败。肉品pH在尸僵时会降低至5.2～5.5，成熟时可升高至5.7～5.8，至自溶和腐败时则升高至6.0以上[17]。本试验发现，健康猪肉pH多在5.75以下，而病死猪肉pH会大于5.75，因此确定pH5.75为判断肉品健康度的标准。但是虽然pH试纸法对于病死猪肉的鉴定效果尚可（阳性检出率为76.3%），但对病死鸡肉效果较差，且对不同储存温度和时间、细菌或病毒感染等因素的研究进一步印证了该结论。分析认为，病死猪肉多来自无害化处理厂采集的样品，多数已经非常不新鲜，已进入自溶和腐败阶段，而病死鸡肉来自于青岛易邦生物工程有限公司样品，多数是当天死亡的，虽不健康但依然新鲜。可见，pH试纸法作为检验肉品新鲜度的指标并不能完全适用于病死畜禽样品的鉴定，这与之前的文献报道一致[12]。

过氧化物酶法鉴定病死畜禽肉是目前采用较为广泛的一种理化方法，还有学者针对此方法研制了便携式速测仪[18-19]。本试验发现，过氧化物酶法仅可用于鉴定病死猪肉样品，无法鉴定病死鸡肉样品。鸡肉样品整体有效性、适用性（死亡当天的病死鸡肉样品检出率低于50%，冷冻30 d的健康鸡肉样品假阳性率也高达40%，对病毒感染鸡肉的检出率仅为29.4%）研究数据都指向了这一结论。因为健康鸡肉样品并不显色，若根据既有的判读依据，健康鸡肉也多显示出假阳性。一般认为健康肉中的过氧化物较高，而病死肉中的较低，因此采用过氧化物酶检测法在猪肉中的检测结果确实如此，而对鸡肉的鉴别效果较差。正如李梅金等[19]利用速测仪发现，健康鸡鸭中的过氧化物酶检测量仅为0.09，而牛肉中的可达2.0。目前国内的研究多集中在利用过氧化物酶法检测猪肉新鲜度和病死猪肉，而对鸡肉中过氧化物酶的检测确实较少。本研究还发现，某些病死鸡肉反而有明显的显色反应。关于此法为何在健康鸡肉中显色不明显，而在病死鸡肉中有明显显色，还有待于进一步研究。

4 结论

本研究发现，硫酸铜沉淀法对病死畜禽产品的总体鉴定有效性较好，对室温当天、冷藏3 d以及冷冻7 d和30 d条件下的样品均有较好的适用性，且对于病毒和细菌感染的样品都适用；微生物毒素法对病死畜禽产品的有效性和适用性差；pH试纸法、过氧化物酶法对病死猪肉的鉴定有效性好，且对不同温度和时间样品的适用性较好，但对病死鸡肉的鉴定效果不佳。综上，硫酸铜沉淀法可用于病死畜禽产品的鉴定，微生物毒素法对病死畜禽样品鉴定较差；pH试纸法、过氧化物酶法可用于鉴定病死猪肉。