杜仲内生细菌拮抗小麦赤霉病菌研究

陈小洁，王 其，张欣悦，丁 婷

(安徽农业大学 植物保护学院，安徽 合肥 230036)

由镰孢属禾谷镰刀菌(FusariumgraminearumSchw.)侵染引起的赤霉病主要危害小麦的穗部，会引起小麦产量下降，危害人畜健康[1-4]，使小麦产生抗药性[5-9]，是对小麦生产威胁最大的真菌病害之一。随着免耕、秸秆还田种植技术的推广，化肥使用量的增加和小麦品种抗性的丧失，该病的发生逐年加重。为此，生物防治在小麦赤霉病的综合治理中显得更为重要。近年来，利用植物内生菌防治病害的研究得到较多关注[10-11]。在众多的生防菌应用中，生防细菌因其种类多、生活周期短、代谢活动快且产物多、繁殖能力高、对病原菌的作用方式多样[12]、易人工培养等特点，在生物防治中起着重要作用[13]。

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)是我国名贵的中药材之一。本试验拟从杜仲中分离内生细菌，以小麦赤霉病菌为指示菌，对杜仲内生细菌进行拮抗细菌的筛选和鉴定。通过活体盆栽试验研究拮抗细菌对小麦赤霉病防治情况，探讨拮抗细菌对小麦赤霉病菌分生孢子萌发过程的影响，初步探索了拮抗细菌对小麦赤霉病菌的抑菌机理。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 材料

杜仲根、叶、茎的健康组织，均于2017年9月10日采自于安徽农业大学校园内种植的健康杜仲。小麦品种为安农1314，小麦赤霉病菌(F.graminearum)由安徽农业大学植物保护学院病理教研室提供。

1.1.2 培养基及药剂

马铃薯葡萄糖固体培养基(PDA)：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，H2O 1 L。

牛肉膏蛋白胨培养基(NA)：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，琼脂15 g。

羧甲基纤维素培养基(CMC)：CMC 15 g，yeast extract 1 g，NH4NO31 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，H2O 1 L。

Landy培养基： L-glutamic acid 5 g·L-1，yeast extract 1 g·L-1，KCl 0.5 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，MnSO4·H2O 5 mg·L-1，L-phenylalanine 2 mg·L-1，FeSO4·7H2O 0.15 mg·L-1，CuSO4·5H2O 0.16 mg·L-1，KH2PO41 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，调节pH至7.0。

供试药剂：50%多菌灵可湿性粉剂WP(江苏三山农药有限公司)；98%多菌灵原药由安徽农业大学植物保护学院病理教研室提供。

练习的设计尽量避免题海战术，做到轻负高效。为了达到这个目的，老师首先要跳入题海，精炼题型，突出重点，提高实效，将学生从繁重的课业中解放出来。

1.2 试验方法

《东风破》典故的使用的比例大大超过了对其他常见修辞格的运用，由下面列出的统计结果(见表2.2)可以看出典故的使用几乎贯穿全歌词。

杜仲内生细菌分离方法参照Ding等[14]的方法，对已纯化的菌株编号，转至NA斜面培养基上，于28 ℃培养箱中培养1～2 d，然后放入4 ℃冰箱保存备用。

利用16S rDNA进行菌种鉴定，采用试剂盒法提取杜仲内生拮抗细菌DZSG23基因组。PCR扩增程序和扩增体系参照Chelo等[18]的方法。将16S rDNA PCR产物纯化后送生物工程(上海)股份有限公司进行测序，所得序列通过NCBI数据库进行Blast比对，并通过MEGA 5.1软件对菌株进行进化分析，确定其分类地位。

采用平板对峙的方法[15]，将小麦赤霉病菌接种于PDA培养基上，在接有病原菌平板的等距离处划线接种杜仲内生细菌，每个处理3个重复，28 ℃培养。待对照组长满培养皿时，测量抑菌带距离，按照如下公式计算抑制率：

菌落生长距离=测量菌落平均直径-5 mm

抑制率(%)=

其中,r为无风险利率;q为股息收益率;σ是波动率;W(t)是一个维纳过程,N(t)是与W(t)独立且强度为λ的Poisson过程;J(t)是t时刻标的资产价格随机跳的相对高度,满足由文献[14]可知Merton跳-扩散模型的特征函数为

1.2.3 生防细菌活体盆栽试验

生防细菌菌悬液制备：将抑菌效果较好的拮抗菌接种于NA液体培养基里，37 ℃、200 r·min-1摇床培养24 h后备用(菌体浓度为1×106CFU·mL-1)。

小麦赤霉病菌分生孢子悬浮液制备：将小麦赤霉病菌接种至CMC培养基振荡培养(25 ℃、全光照或光照12 h·d-1、180 rpm·min-1培养4 d)，获得小麦赤霉病菌分生孢子，调节孢悬液浓度至1×105CFU·mL-1。

将小麦种子(安农1314)进行催芽处理，24 h后选取露白状况一致的种子分别浸于灭菌NA液体培养基或拮抗菌发酵培养物中5 h[16]，然后分别播种在花盆中。每盆播种15粒，待小麦长至扬花期进行如下处理。

(1)空白对照(CK)：在长势相当的小麦穗上喷施无菌的NA液体培养基，套袋保湿48 h后正常水肥管理。

(2)小麦赤霉病菌处理(B)：在长势相当的小麦穗上单花滴注接种小麦赤霉病菌孢悬液，套袋保湿48 h后正常水肥管理。

1.2.5 拮抗菌株DZSG23对小麦赤霉病菌的拮抗作用

(4)多菌灵+小麦赤霉病菌处理(Y)：将配置好的50%多菌灵可湿性粉剂500倍溶液直接喷洒于小麦穗上，套袋保湿48 h后单花滴注接种小麦赤霉病菌孢悬液，继续套袋保湿48 h后正常水肥管理。

接种小麦赤霉病菌后的第4、7、10、14、17天对不同处理组进行病害调查，计算病情指数和防效。结果见表2。随着处理时间的延长，B、SB和Y处理组赤霉病的病情指数均呈缓慢增长趋势，接种病原菌第10天，B处理组病情指数达到68.62，而同一生长期的DZSG23处理组小麦发病较轻，病情指数仅为40.56，与Y处理组差异显著，但显著低于DZSJ16处理组和DZSG09处理组；截至第17天，B处理组病情指数达到86.49，而同一生长期的DZSG23、DZSJ16和DZSG09处理组和Y处理组小麦病情指数分别为62.73、78.48、71.12和53.27。上述结果说明，在小麦中引入DZSG23菌株可显著提高小麦植株对赤霉病的抗性，降低赤霉病的发病率。

灭菌载玻片中央放置15 mm × 10 mm的无菌PDA薄膜一块，分别接种DZSG23和小麦赤霉病菌于PDA薄膜两平行边的中点，放置于28 ℃恒温培养箱内保湿培养，逐天镜检两菌的相互作用并显微拍照。

1.2.4 DZSG23的种群鉴定

1.2.2 拮抗细菌的筛选

if(oldState!=null&&value=="initiated")OnStateInitiatedChange(myEventArgs);

(3)拮抗菌+小麦赤霉病菌处理组(SB)：将拮抗菌菌悬液直接喷洒于小麦穗上，套袋保湿48 h后单花滴注接种小麦赤霉病菌孢悬液，套袋保湿48 h后正常水肥管理。

1.2.6 拮抗菌株DZSG23对小麦赤霉病菌分生孢子萌发的影响

国家之强弱，视教育发达与否为标准。东西各国规定义务教育，凡学龄儿童已达就学之期，非有不得已事故不得废学，否则罪其父母，此教育之所以溥及而国乃以强盛。方今民国初定，百端待理，顾尤以普及教育为根本之要图。而谋普及教育，须从调查学龄儿童入手，某地应添设学校几所，某地应需经费若干，种种设施，皆恃是以为准则。而以学龄儿童之人数比较就学差数之多少，尤足觇各地文化之迟速。[13]

问：我奶奶85岁，有痔疮而且腹泻严重，几乎吃点东西就要上厕所，肚里存不住东西，这样对老人身心健康不利，家人很担心，去医院也查不出什么问题。请问杨老师如何治疗，或是吃点什么补品？

DZSG23菌悬液和次级代谢产物制备：拮抗菌DZSG23接种于NA液体培养基，37 ℃、200 r·min-1摇床培养24 h，离心后分别取上清发酵液和菌体。发酵液冻干为次级代谢产物，菌体无菌水重悬(菌悬液浓度为1×106CFU·mL-1)，-20 ℃冰箱备用。

CMC培养基培养小麦赤霉病菌的分生孢子，病原菌孢悬液浓度调节至1×105CFU·mL-1。试验设置4个处理：空白对照、98%多菌灵、DZSG23菌悬液、DZSG23次级代谢产物。其中，98%多菌灵和DZSG23次级代谢产物分别与0.5 mL 1×105CFU·mL-1的赤霉病菌孢悬液和适量PDA液体培养基混合，终体积为5 mL。使98%多菌灵终浓度达到5、10 μg·mL-1，DZSG23次级代谢产物终浓度达到5、10 mg·mL-1，赤霉病菌孢悬液浓度达到1×106CFU·mL-1。置于28 ℃培养箱中，分别于培养6、12、24、30和36 h观察不同处理组的小麦赤霉病菌分生孢子萌发、分生孢子芽管形态和菌丝体的形成等，测定小麦赤霉病菌分生孢子的萌发率和畸形率。

2 结果与分析

2.1 拮抗细菌的分离筛选

从杜仲的根、茎、叶中共分离得到104株内生细菌，如表1所示。采用16S rDNA初步鉴定出104株内生细菌分别属于芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、伯克氏菌属(Burkholderia)、贪铜菌属(Cupriavidus)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)6个属，菌株的GenBank登录号如表1所示。其中，芽孢杆菌属(Bacillus)内生细菌共39株，占分离内生细菌总数的37.50%，在杜仲的根、茎、叶中广泛分布。

采用平板对峙法测定104株杜仲内生细菌对小麦赤霉病菌的抑菌活性，结果如表1所示。抑菌率超过60%的分别为DZSG09、DZSJ16、DZSG23，其中，DZSG23对小麦赤霉病菌的抑制率达到了69.04%。后续试验选择上述3株菌株开展对小麦赤霉病防治的盆栽试验。

表1 杜仲内生细菌对小麦赤霉病菌的抑制作用

续表1

表中所列数据为3个重复的平均值。

Data listed in the table were the average of 3 replicates.

2.2 拮抗细菌对小麦赤霉病菌的盆栽防效试验

每种处理设3盆作为重复，分别在接种小麦赤霉病菌后的第4、7、10、14、17天进行病情调查。小麦赤霉病的病情严重度分级标准参考李洪连等[17]的方法，公式如下：

1.2.1 杜仲内生细菌的分离

2.2 两组右侧基底节区各代谢物比值的比较 结果(表1，图1)表明：HIE组患儿中右侧基底节区NAA/Cho、NAA/Cr明显低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；HIE组患儿中右侧基底节区Lac/Cr高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。

隐喻是大学生心理活动的重要表现形式。探索大学生隐喻可以揭示大学生内心的心理取向。此研究主要是了解大学生的隐喻意识以及使用隐喻的价值取向。主要研究以下问题：

2.3 杜仲内生细菌的种群鉴定

以DZSG23基因组DNA为模板，PCR扩增16S rDNA序列并测序。NCBI序列比对发现，DZSG23的16S rDNA序列与枯草芽孢杆菌B.subtilis(KC146707.1)的核苷酸序列相似性最高；采用DNAMAN软件，构建菌株16S rDNA序列系统发育树，发现DZSG23与枯草芽孢杆菌B.subtilis聚成一个分支，说明菌株DZSG23与芽孢杆菌属各菌株亲缘关系最近，而与肠杆菌属各菌株的亲缘关系相对较远(图1)。因此，初步鉴定菌株DZSG23为芽孢杆菌属(Bacillussp.)株系。

究竟什么原因造成“放炮”呢？能不能降服甚至消灭“炮老虎”，打破外国专家“放炮难免”的断言呢？高压聚乙烯车间干部员工绞尽了脑汁，董松江也在暗中较劲。

2.4 DZSG23对小麦赤霉病菌菌丝生长的抑制

在接种小麦赤霉病菌4 d后，对照平板上小麦赤霉病菌菌丝体生长旺盛且长满整个平板(图2-a)，而在接种芽孢杆菌DZSG23的平板上小麦赤霉病菌受到抑制，形成明显的抑菌带(图2-b)。对抑菌带内的小麦赤霉病菌菌丝进行显微观察发现，小麦赤霉病菌菌丝明显膨大、扭曲变形(图2-d箭头所示)，而对照的菌丝形态正常，无异常变化(图2-c)。

（4）Cl-在 H-103树脂上的吸附熵变 ΔS＞0，表明在Cl-的吸附过程中同时存在着溶剂的解吸，吸附熵变ΔS变化很小，ΔS变化范围为0.004～0.1 k J·mol-1。

表2 接种赤霉病菌不同时间小麦赤霉病的病情指数

“—”表示无此项。同列数据后无相同小写字母表示0.05水平上差异显著。

“—” means no defense. Data without the same letters in a column indicated significant differences according to Duncan’s multiple range test (α=0.05)

图1 DZSG23菌株16S rDNA序列的进化分析Fig.1 Phylogenetic tree of the strain DZSG23 based on 16S rDNA

2.5 拮抗菌株DZSG23对小麦赤霉病菌分生孢子的影响

2.5.1 分生孢子萌发

不同时间段，以空白对照为阴性对照，分别检测98%多菌灵、DZSG23菌悬液、DZSG23次级代谢产物处理组中小麦赤霉病菌分生孢子的萌发率，结果如图3所示。不同处理组小麦赤霉病菌的分生孢子萌发速率存在较明显差异，98%多菌灵处理组和DZSG23菌悬液一定程度上均能延缓分生孢子萌发时间。截至第36小时，5、10 μg·mL-1的98%多菌灵处理后的小麦赤霉病菌分生孢子萌发率分别为98.56%和93.22%，DZSG23菌悬液(1×106CFU·mL-1)处理的小麦赤霉病菌分生孢子萌发率为98.04%，与多菌灵处理组无明显差异；而DZSG23次级代谢产物处理组对小麦赤霉病菌分生孢子萌发的抑制作用较小，病原菌分生孢子在12 h后几乎全部萌发。说明，DZSG23菌悬液可减缓小麦赤霉病菌分生孢子的萌发速率，但36 h后不能抑制孢子的萌发，而其次级代谢产物对小麦赤霉病菌分生孢子的萌发几乎无影响。

“医院从2015年开始推行‘岗位目标责任书’，就是为了规避部门制定目标时的种种问题。从那时，我们就提出，由医院整体核定目标。”韩建峰表示，医院结合西安交通大学办学定位、医院五年规划等制定目标，把目标进行分解，细化到每一年，使医院发展有比较具体的目标。每一年的落实中，每个职能科室结合实际情况制定目标。

a，小麦赤霉病菌培养4 d；b，菌株DZSG23与小麦赤霉病菌对峙培养4 d；c，正常的小麦赤霉病菌菌丝形态；d，变形的小麦赤霉病菌菌丝形态。a， F. graminearum cultured for 4 days; b， Confront antibiotic culture experiment of strain DZSG23 and F. graminearum for 4 days; c， Shape of normal mycelia of F. graminearum; d， Shape of deformed mycelia of F. graminearum.图2 菌株DZSG23与小麦赤霉病菌的对峙培养结果Fig.2 Confront antibiotic culture experiment of strain DZSG23 and F. graminearum

a，多菌灵处理；b，菌悬液处理；c，次级代谢产物处理。a， Carbendazol; b， DZSG23 suspension; c， Secondary metabolites of DZSG23.图3 不同处理对小麦赤霉病菌分生孢子萌发速率的影响Fig.3 Effects of different treatments on the conidiospore germination rate of F. graminearum

2.5.2 分生孢子畸形率

以空白对照为阴性对照，分别检测98%多菌灵、DZSG23菌悬液、DZSG23次级代谢产物处理组中小麦赤霉病菌分生孢子的畸形率，结果如图4所示。随着处理时间的延长，不同浓度多菌灵的添加均可以快速增加小麦赤霉病菌分生孢子的畸形率，截至第36小时，5、10 μg·mL-1多菌灵处理组赤霉病菌分生孢子致畸率分别为97.63%和96.29%；DZSG23菌悬液(1×106CFU·mL-1)也可迅速提高小麦赤霉病菌分生孢子的畸形率，处理6 h，畸形率达14.50%，处理36 h，畸形率升高至57.70%；DZSG23次级代谢产物的致畸作用相对较低，截至第36小时，5、10 mg·mL-1次级代谢产物处理组对赤霉病菌分生孢子致畸率仅分别为30.46%和36.67%。处理6 h不同处理组中的赤霉病菌分生孢子形态如图5所示，空白对照组的赤霉病菌分生孢子大多从顶端萌发，萌发形成的菌丝光滑而均匀；与此同时，多菌灵、DZSG23菌悬液及其次级代谢产物处理的病原菌分生孢子及其芽管均出现膨大、扭曲和畸形等现象。

针对实际训练中常常存在过拟合的问题,本文采用 Dropout方法来对神经网络进行正则化[14]。由于大棚中环境变量数据量大且变化缓慢,所以在训练过程中以0.1的概率随机丢弃网络中的一些神经元以及相互之间的权重连接,提升模型的泛化能力,不易对训练数据过拟合。

a，多菌灵处理；b，菌悬液处理；c，次级代谢产物处理。a， Carbendazol; b， DZSG23 suspension; c， Secondary metabolites of DZSG23.图4 不同处理对小麦赤霉病菌分生孢子畸形率的影响Fig.4 Effects of different treatments on conidiospore deformity rate of F. graminearum

a，空白对照；b，多菌灵(4 μg·mL-1)处理；c，菌悬液(1×106 CFU·mL-1)处理；d，次级代谢产物(10 mg·mL-1)处理。a， Blank control; b， Carbendazol(4 μg·mL-1); c， DZSG23 suspension(1×106 CFU·mL-1); d， Secondary metabolites of DZSG23(10 mg·mL-1). 图5 不同处理6 h后的分生孢子及其芽管畸形Fig.5 Abnormality of conidia and their germ tubes under different treatments for 6 h

3 讨论

本研究以小麦赤霉病菌为靶标，筛选获得一株具有较高抑菌活性的杜仲内生细菌DZSG23，将其引入小麦，可明显提高小麦植株对赤霉病的抗性，减少赤霉病对小麦的危害。进一步的研究表明，芽孢杆菌DZSG23可引起小麦赤霉病菌菌丝的肿胀、膨大，降低孢子萌发速率，并使分生孢子及其萌发出的芽管畸形。该试验结果为抗小麦赤霉病拮抗菌的筛选及生防机理研究提供了理论基础。

植物内生菌作为一种新型的微生物资源，近年来在植物病害生物防治中发挥着重要的作用[19-21]。杜仲作为中国传统的药用植物，不容易被植物病虫害感染，具有抗菌、抗肿瘤、增强免疫功能等药理活性[22]，因此，从杜仲中分离筛选拮抗内生菌在实际生产中具有较好的应用前景。本研究以安徽农业大学校园中生长多年的健康杜仲植物为材料，进行内生细菌的分离纯化，最终获得内生细菌104株，分属于6个属：芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、伯克氏菌属(Burkholderia)、贪铜菌属(Cupriavidus)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)，这与已有的从杜仲健康组织中分离到的内生细菌种群相比[23]，仅有短芽孢杆菌属、芽孢杆菌属等少数种群一致，而分离出的其他细菌的数量和种类均有差异。究其原因，一方面可能是由于内生菌依附的寄主植物受生长环境、气候等外界因素的影响，其生长状况和生理特性均存在差异；另一方面，本试验以NA培养基作为内生细菌分离纯化的培养基，但由于不同菌株要求的营养条件不同，因此，可能导致一些生长条件比较苛刻的专性内生细菌难以生长，反映在试验结果上，即分离出的杜仲内生细菌在种群数量上与相关文献报道均存在一定的差异。

该研究中获得的对小麦赤霉病菌具有较好拮抗活性的DZSG23，经16S rDNA鉴定为芽孢杆菌属微生物。芽孢杆菌作为重要的生物防治资源，广泛存在于土壤等自然环境中，亦是常见的植物内生菌，在玉米、水稻等多种植物中均有其分布[24-25]，其可通过产生抑菌物质、竞争作用、诱导寄主植物产生抗病性等多种机理抑制植物病原菌生长，在防治植物病害中发挥重要作用。如杨瑞先等[26]从牡丹根部组织中分离出的2株解淀粉芽孢杆菌Md31和Md33均具有合成脂肽类物质的能力，且2个菌株的脂肽类粗提物也具有较强的体外抑菌活性。姬婧媛等[27]发现植物内生枯草芽孢杆菌菌株E1R-j产生的抗菌脂肽类物质可对小麦全蚀病菌菌丝有抑制作用，可使菌丝细胞畸形、细胞壁溃解、细胞质外渗等。本研究发现，芽孢杆菌DZSG23不仅可引起小麦赤霉病菌菌丝的肿胀、膨大，还可降低孢子萌发速率，引起分生孢子细胞及其芽管产生畸形。引起上述现象的原因是否是芽孢杆菌属微生物DZSG23产生的抑菌物质而导致的尚不明确，因此后续试验中，将开展DZSG23相关脂肽类抑菌物质的研究，在明确拮抗菌株DZSG23所产生的抑菌物质种类的同时，明晰其脂肽类物质的抑菌活性。此外，由DON毒素引起的麦粒中毒是我国和其他一些国家最主要的真菌性食物中毒之一，目前，DON毒素的分析检测及毒性研究倍受重视[28-29]。该研究仅开展了DZSG23菌株对小麦赤霉病的盆栽防控评价及其对赤霉病菌菌丝和分生孢子的影响，而DZSG23菌株的引入能否抑制小麦赤霉病菌毒素的产生尚不清楚。因此，后续试验中将利用高效液相色谱法对其开展深入研究，明确拮抗菌株对赤霉病菌毒素产生的影响机制。

迄今为止，小麦赤霉病仍以喷施化学杀菌剂为主，然而，长期大量的施用杀菌剂，不仅诱发产生抗药禾谷镰孢菌菌株[6]、农药残留超标[30]，还促进毒素生物合成[31]，也造成环境污染。近年来，大量的研究工作围绕小麦赤霉病拮抗生防菌的筛选和相关抑菌机制进行展开，并获得了较多的拮抗微生物。管章玲等[32]从多种植物体和土壤中分离出30株对禾谷镰刀菌有明显抑制作用的菌株，菌株NS-QCT的抑菌活性最强。王建伟[33]发现其筛选的菌株AF0907是通过分泌某种抗菌物质来抑制小麦赤霉病菌的，初步鉴定该抗菌物质为蛋白质。且部分微生物已经获得农药登记许可证[34]，但是多数拮抗微生物虽在实验室条件下能表现出良好的抑菌活性，但在大田条件下，由于环境条件的改变，不能很好地适应田间微环境，无法快速生长繁殖，从而难以发挥抑菌作用，导致生防效果不尽理想。因此，提高生防菌在田间地上部位和根际的定殖、快速繁殖能力，是拮抗微生物田间施用中需要考虑并解决的问题。后续研究中，该试验计划利用基因标记或抗药性标记等技术，进一步研究DZSG23在植株的定殖动态，提高其在小麦中的定殖效能。