色素失禁症一家系NEMO基因突变检测

贾 宁 魏 翔 葛若木 刘江波 李 明 张素梅

色素失禁症(incontinentia pigmenti, IP, OMIM308300)，是一种少见X染色体显性遗传病，可伴随多系统发育障碍，可累及牙齿、眼睛、中枢神经系统和其他器官，以皮肤损害为典型特征[1]。皮肤典型的临床表现分为四期，第一期为红疹-水疱，线性分布于躯干或肢端，可在出生及出生两周后出现；第二期为疣状角化丘疹和斑块，分布于肢端，出生2～6周后出现；第三期色素沉着，沿Blaschko线条纹状或旋涡状分布于躯干，在出生12～26周后出现；第四期苍白萎缩性斑块或色素减退，可在青春早期到成年的任何时期出现[2]。 这四个阶段的皮损可同时出现或依次出现。 2000年，Smahi[3]等发现NEMO(inhibitor of κ polypeptide gene enchancer in B cells)基因突变是色素失禁症病因，该基因组重排可修复NF-κB活性。 Minic[4]等总结发现NEMO 外显子4～10大片段缺失存在于70%～80%患者中，其它突变为该基因点突变或移码突变等，目前已报道出53个不同突变位点。本文报道1例中国汉族色素失禁症家系(图1)，对NEMO 基因进行外显子测序，发现位于第5号外显子存在新的移码突变c.723_c.724insCAGG并在家系内传递，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 对象 先证者，女，5岁。2012年9月出生，于2013年1月外院检查发现四肢、腋下、腹部及背部见散在大小不等，形状不规则的褐色色素沉着，眼睛、牙齿及神经系统查体无特殊。至2018年2月复检发现躯干和四肢可见漩涡状泼墨样色素沉着斑，余未见明显异常(图2a、2b)。2018年4月入我院检查，表现同2018年2月。先证者母亲，即家系内成年患者，出生时即有皮疹，成年后可见躯干及双下肢呈现条索状色素减退斑块，但无其他外胚层发育不良表现。病程类似先证者，但病情与之相比较轻(图2c)。除先证者及家系内患者，家族中其他人无明显异常(图1)。结合临床表现及Sanger测序结果，诊断为：色素失禁症。

1.2 方法

1.2.1 外周血基因组DNA提取 经由新华医院允许，并获得患者及家属的知情同意，我们收集先证者和母亲以及其余正常家属的外周血2 mL至含2%EDTA抗凝剂管，-20℃储存，并采用盐析法提取基因组DNA。同时，对100名正常人的外周血也进行基因组DNA提取，作为健康对照，以排除基因多态性干扰。

1.2.2 引物设计及PCR 采用聚合酶链式反应对基因组DNA 进行扩增。NEMO基因引物由上海生工生物工程有限公司进行设计及合成，巢式PCR扩增反应由上海安百隆生物技术有限公司完成。巢式PCR分为两轮反应，第一轮反应目的为去除同源序列，第二轮反应目的为扩增目的片段。NEMO第5号外显子引物序列如下：第一轮引物：上游5’-ACTGAAAACCCACTTTAGCA-3’，下游5’-GCAGTCTAGGAAAGAACTCC-3’；第二轮引物：上游5’-GCAAACA CGTCTTAAGCAAA-3’，下游5’-CAGATTGGATGCTGGTA GAC-3’。PCR扩增程序如下：第一轮反应：3 min升温至95℃，并在95℃变性持续30 s，于55℃退火，持续30 s，于72℃延伸，持续10 min，共35个循环，72℃终极延伸5 min。第二轮反应：与第一轮反应基本一致，但72℃延伸，持续30 s，共35个循环，72℃终极延伸5 min。

1.2.3 MLPA及Sanger测序 MLPA用于检测NEMO基因是否存在大片段缺失。Sanger测序用于检测NEMO基因外显子及侧翼序列是否存在突变。此两种测序均在上海安百隆生物科技有限公司进行，ABI 3730测序仪用于检测MLPA PCR产物，并以ROX500 SIZE为标准，后应用Coffalyzer 7.0进行数据分析。ABI 3730XL用于检测Sanger PCR产物，并以已报道的NEMO未突变序列为参照，采用Chromas 2.0软件进行结果分析。

图1IP家系图图22a,2b：四肢及躯干沿Blaschko线条纹状或旋涡状分布的色素沉着斑；2c：先证者母亲双下肢网格状色素减退斑

图3 IP家系NEMO基因MLPA检测结果(3a,3b,3c分别是先证者，先证者母亲，家系内正常人)：均无大片段缺失

2 结果

利用MLPA检测该家系先证者、母亲及正常人的NEMO基因是否存在大片段缺失， 结果表明，家系内三位被检测者的NEMO基因均无大片段缺失(图3a-3c)。利用Sanger测序检测该家系先证者、母亲及正常人的NEMO基因点突变情况，结果表明，先证者NEMO基因第5号外显子检测出移码突变c.723_c.724 insCAGG，在基因组723位插入CAGG四个连续碱基致终止密码子提前出现，导致第256位表达氨基酸由精氨酸(Arg)变成终止密码子(Stop)(p. A241fsX256)，形成截短NEMO蛋白(图4a)。家系内患者也检测出相同位点突变(图4b)。 表型正常的其他家族成员及100名健康对照未发现此突变位点(图4c)。

图4IP家系NEMO基因突变检测结果(4a,4b,4c分别是先证者，先证者母亲，家系内正常人)：先证者及母亲检出相同突变，家系内正常人未检出此突变

3 讨论

自从1925年Bruno Bloch[5]首次发现色素失禁症以来，越来越多的散发病例或家系病例被报道。 该病是一种少见的X染色体连锁显性遗传性疾病，常表现为外胚层发育障碍，可影响多个系统正常发育，同时伴有皮肤异常表现，成年后常表现为皮肤色素减退或皮肤萎缩。 尽管有男性患者的存活病例，但是色素失禁症常见于大部分女性患者，且在同一家系的女性间传递[6]。 然而，仍存在一些少见的遗传方式，如在父女间传递，表型正常的父母生出多个IP患儿等，也可能间接说明除了NEMO基因突变，还有其他因素也导致色素失禁症发生[7,8]，当然NEMO基因的嵌合突变也可以导致上述情况的发生，该病目前尚无特殊疗法。

在本研究中，家系内成年患者被检测出NEMO基因突变，表现出前臂及大腿处轻微皮肤改变，而检出相同突变的先证者，在躯干及双下肢均可见典型第三期色素失禁症皮肤损害，截止到目前为止尚未发现伴随的其他系统异常，但是皮损也可能伴随其他皮肤附件的损害，如头顶部脱发、趾甲营养不良等[9]。 甚至已有几例色素失禁症病例在童年时期与肿瘤形成有关[4，10]。 所以，定期随访是防治的必要措施。

既往文献中有数例5号外显子点突变导致IP的病例报道。Minic等[10]于2015年报道一个散发IP病例的致病基因测序结果显示5号外显子存在c.641_647delGC ATGGAinsAT，并且此突变未在其他正常人中检测到。该患儿临床表现为典型的IP皮肤病损，伴有圆锥形齿及牙齿发育延迟。Aradhya等[11]于2001年在357个IP病例中发现277个突变，NEMO测序结果显示有7个突变发生在5号外显子。其中，在c.570_574del突变的IP病例仅表现为牙齿病变，而另一个c.653_659dup突变的病例则在眼部和牙齿均出现病变。在本次研究中，先证者的基因测序结果也显示在5号外显子存在突变(c.723_c.724insCAGG)，并且患者出现明显的三期IP皮肤病变。且此突变仅在先证者及家系患者被检测到，在家系正常人及100名健康对照中均未被检测到。且此突变尚未在既往文献中被报道。

NEMO/IKBKG(inhibitor of κ polypeptide gene enchancer in B cells)突变是色素失禁症(IP)主要致病因素。 Smahi等[3]第一次发现NEMO基因突变直接参与色素失禁症形成。 NEMO基因位于X染色体，其编码蛋白是IKK复合体调节亚基IKKγ(NEMO)[12]。NEMO蛋白有多个功能域，包含2个螺旋功能域(HLX1，HLX2)、2个卷曲功能域(CC1，CC2)、1个NEMO 泛素结合域(NUB)、1个亮氨酸拉链(LZ)和1个锌指结构域(ZF)[13]。本研究中，患者X染色体上NEMO基因5号外显子发生移码突变，导致终止密码子提前出现，形成截短的NEMO蛋白，除了HLX1和CC1两个功能域被保留，CC2至ZF功能域均缺失。既往研究表明，NEMO介导NF-κB 活化的途径，都是通过NEMO的泛素结合功能域去识别非降解泛素链的蛋白[13]，该功能的实现的必需因素包括CC2低聚化和ZF功能域与K63-连接的聚泛素链连接等[13，14]。所以此突变损害NEMO活性，即NEMO二聚化和聚泛素链连接的能力会受到影响，进而IKK复合体催化亚基活化及NEMO激活都不同程度受到影响。NF-κB是NEMO蛋白下游结合分子，参与许多生理活动，包括炎症免疫反应、细胞凋亡及胚胎发育等。NEMO活性损害导致NF-κB 活化受阻，进而影响上述生理过程[15]。

色素失禁症与NEMO蛋白功能障碍相关，尽管截短NEMO能与IKK复合体其他亚基进行功能联系，但是不能参与激活NF-κB通路，同时，色素失禁症患者的胚胎纤维母细胞在体外实验中缺乏NF-κB活化表现也证实这一点[12]。虽然我们针对NEMO的外显子及侧翼序列进行测序，但是不排除基因的其他调节作用的区域也包含潜在的致病突变位点，如启动子区域和非编码区域等。总之，此次结果进一步扩大色素失禁症致病基因NEMO的突变谱，为探究突变NEMO蛋白的功能打下基础。。