白花蛇舌草提取物对脓毒症模型小鼠肝组织病理及IL-6、IL-1β和TNF-α的影响

何枝华，彭梦媛，王颖芳，2*

(1.广东药科大学 中药学院，广东 广州510006；2.广东省局部精准药物递药制剂工程技术研究中心，广东 广州510006)

脓毒症(Sepsis)是由感染引起的全身炎症反应综合征(SIRS)，是发病率和死亡率极高的临床综合征，全球每年有数百万人罹患脓毒症，其中25%甚至更多的患者死亡[1]。如何改善脓毒症患者机体的免疫功能，降低病死率是目前亟待解决的问题。中医认为感染属于毒热证范畴，病机为“热毒炽盛”，而脓毒症各个时期都可存在严重感染，使用清热解毒法解决“毒邪”这一主要矛盾，可取得良好疗效[2-5]。

白花蛇舌草为茜草科植物白花蛇舌草HedyotisdiffusaWilld. 的干燥全草。微苦、微甘、微寒，归心、肝、脾经，具有清热解毒、消肿止痛之功效。临床常用于治疗阑尾炎、肝炎、泌尿系统感染、支气管炎、扁桃体炎、喉炎等多种炎症疾病，但其作用机理尚不明确，报道极少。本实验观察了白花蛇舌草提取物对脓毒症小鼠炎症的影响，通过检测小鼠血清炎症因子水平和肝脏的病理学变化，探究其抑制脓毒症小鼠炎症可能的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级KM小鼠80只，雌雄各半，体重18～22g，由南方医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(粤)2016-0041。

1.2 药物与试剂

白花蛇舌草(广东省中医院大学城医院提供，提取物由实验室自制)；LPS(北京索莱宝科技有限公司)；地塞米松磷酸钠注射液(广东省中医院大学城医院)；小鼠ELISA试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司)。

1.3 仪器

低温高速离心机(德国HERMLE)；电子天平(日本Satorius)；酶联分析仪(Tecan genio公司)；BH-2显微镜(日本奥林巴斯公司)。

2 试验方法

2.1 动物分组、建模及给药

将80只小鼠按体重随机分为空白对照组、模型组、地塞米松干预组和白花蛇舌草水提组、白花蛇舌草醇提组，地塞米松干预组和白花蛇舌草水提组、醇提组连续灌胃7天，其余各组给予等体积生理盐水；末次给药30 min后，除空白对照组外，其余各组小鼠腹腔注射LPS(10 mg/kg)造模，空白组给予等体积生理盐水，1次/天持续至实验结束。

2.2 指标观测

2.2.1 动物临床症候观察 造模后分别于6 h、12 h、24 h、48 h观察各组小鼠体表症状，如精神、食欲、大小便、毛发色泽等。

2.2.2 血清炎症因子检测 于造模后6 h、12 h、24 h、48 h小鼠眼眶取血，分离血清备用，按ELISA试剂盒步骤进行操作，检测IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

2.2.3 肝脏组织病理观测 分别于造模后6 h、12 h、24 h、48 h采用颈椎脱臼法处死小鼠，统一剪取肝左上叶置于中性福尔马林溶液中固定，经脱水、包埋、切片、HE染色等操作后于光镜下观察病理变化。

2.3 数据处理与分析

3 实验结果

3.1 小鼠临床症候观察

空白组小鼠反应敏捷，精神、食欲、大小便均正常，毛发均匀光泽。模型组小鼠在造模6 h后开始出现精神萎靡，毛发蓬松不洁，寒颤发抖，大小便失禁，食欲下降等临床症候，12 h后症状开始明显加重。白花蛇舌草提取物组造模后同时间段也出现进食减少、活动量减少的症状，但呼吸、精神、毛发等情况均明显优于模型组，24 h后上述症状开始明显好转。

3.2 小鼠血清炎症因子水平比较

与空白对照组比较，模型组的小鼠血清炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平明显升高(P<0.01)，白花蛇舌草水提组、醇提组小鼠血清炎症因子IL-6水平显著高于空白组(P<0.01)，IL-1β、TNF-α水平也明显高于空白组(P<0.05)，但各时间节点上述炎症因子水平均显著低于模型组(P<0.05)，6-12 h时间段各炎症因子达到峰值，24 h时各炎症因子水平显著低于6 h时炎症因子水平(P<0.01)，48 h后开始趋于正常水平。见表1、表2、表3。

表1 各组小鼠血清IL-6水平比较

组别动物数(n)6h12h24h48h空白对照组164.47±0.381.62±0.070.41±0.140.34±0.46模型组1613.62±0.11∗∗11.70±1.01∗∗2.64±1.560.65±0.14∗地塞米松组1610.37±0.31∗∗▲2.67±0.45▲1.31±0.460.58±0.98∗HD水提物组1611.45±0.42∗∗▲9.51±1.81∗∗1.48±0.32∗0.62±0.18∗HD醇提物组1611.32±0.04∗∗▲10.08±2.83∗∗1.81±0.820.54±0.07∗

注：与空白组比较，**P<0.01；与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，▲P<0.01；与模型组比较，●P<0.05。下同。

表2 各组小鼠血清IL-1β水平比较

组别动物数(n)6h12h24h48h空白对照组160.26±0.070.17±0.070.28±0.060.30±0.07模型组161.94±1.36∗1.75±0.870.29±0.060.41±0.13地塞米松组160.38±0.13▲0.21±0.10▲0.26±0.030.31±0.10HD水提物组161.34±0.21∗0.25±0.04▲0.28±0.010.37±0.13HD醇提物组161.25±0.27∗0.24±0.04▲0.27±0.020.28±0.02

表3 各组小鼠血清TNF-α水平比较

组别动物数(n)6h12h24h48h空白对照组160.20±0.020.11±0.000.04±0.040.16±0.07模型组160.88±0.74∗0.25±0.160.10±0.03∗0.08±0.02∗地塞米松组160.22±0.03●0.08±0.04●0.13±0.07∗0.11±0.04HD水提物组160.31±0.12●0.09±0.06●0.07±0.050.06±0.04∗HD醇提物组160.34±0.12●0.11±0.020.09±0.040.08±0.03∗

3.3 小鼠肝脏组织病理变化

正常组小鼠肝脏肝小叶结构完整，肝细胞以中央静脉为中心向四周呈放射状排列，未见肿胀、变性或坏死。模型组小鼠肝细胞可见明显肿胀、变性，大部分细胞边界及细胞核模糊不清，有炎性细胞浸润，肝细胞脂肪样变性，可见部分细胞凋亡，24 h后，病变情况逐渐减轻。白花蛇舌草提取物组和阳性组小鼠肝损害较模型组明显减轻，肝小叶结构较清晰，少数肝细胞有轻微水肿，其余未见明显异常变化。见图1。

图1各组小鼠肝组织病理变化(HE染色，×200)

4 讨论

脓毒症是创伤、烧伤、休克、感染等临床急危重患者的严重并发症之一，也是诱发脓毒性休克、多器官功能障碍综合征(MODS)的重要原因。脓毒症严重时，由于内毒素刺激机体，促使炎性细胞特别是中性粒细胞和巨噬细胞在组织中募集和活化，然后分泌一系列炎症介质如细胞因子、趋化因子、氧自由基及蛋白酶等，互成反馈，不断扩大炎性反应，形成瀑布样级联反应[6-7]。据研究表明，病原微生物与TLR4受体结合后激活特异的下游信号传导通路，介导大量炎症细胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6，以及次一级炎症介质等的合成和释放与脓毒症的形成紧密相关[8]。

基于此，本研究通过双抗体夹心酶联免疫吸附法检测LPS脓毒症模型小鼠各时间节点血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量变化，并结合肝脏病理学变化，观察白花蛇舌草提取物对LPS脓毒症小鼠炎症的干预效果，探讨白花蛇舌草提取物对外周血中相应炎症因子蛋白表达的调节作用，进一步明确白花蛇舌草的抗炎作用机制。

本实验结果提示，白花蛇舌草水提取物和醇提取物均能够有效改善LPS脓毒症小鼠的肝损伤，抑制IL-6、IL-1β、TNF-α水平，其作用机制可能是通过抑制这些炎症因子的表达，来调节固有免疫系统的平衡，从而达到治疗效果。

有研究表明，TLR4/MyD88/NF-κB信号转导途径在脓毒症发生发展中起着重要作用，胞外的LPS通过细胞膜上的TLR4受体激活胞内的NF-κB转录因子最终导致多种炎症介质的大量转录表达[9]。下一步本课题组拟应用Real-time Quantitative RT-PCR方法研究TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的关键因子在白花蛇舌草提取物干预LPS脓毒症模型小鼠后多个时间点肝组织中的转录水平，进一步验证白花蛇舌草提取物在固有免疫方面的抗炎作用机制，明确其作用靶点，为白花蛇舌草在临床上的进一步应用提供参考依据。