柿叶总黄酮提取纯化工艺研究

周雅阳，杜 江

(贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002)

柿叶为柿科柿属植物柿(DiospyroskakiThunb.)的新鲜或干燥叶，在我国分布广泛，作为药用植物具有悠久的历史，始载于《滇南本草》[1]，《本草再新》中记载其具有治疗咳嗽吐血、止渴生津之功效。柿叶中含有丰富的维生素、芦丁以及铁、锌、钙等对人体健康有益的多功能营养成分，现代药理学研究表明柿叶具有清热解毒、润肺强心、镇咳止血、改善血管通透性等多种医疗保健功能[2]。黄酮作为柿叶的有效成分之一，具有降血糖、抗菌、抗肿瘤、止血、调血脂、改善微循环等药理作用[3-5]，药用价值高，开发前景乐观。目前，国内对柿叶中总黄酮的研究报道颇多，但提取工艺不尽相同，也没有进行深入探讨和比较。因此，本实验对柿叶有效部位总黄酮的提取纯化工艺进行系统研究，为柿叶的开发利用提供实验依据。

1 仪器与试药

岛津LC-20A高效液相色谱仪(二极管阵列检测器，LC-20A色谱工作站)；电子天平(ME204E/02梅特勒-托利多仪器有限公司)；冷冻干燥机(LGS-18，北京松源华兴科技发展有限公司)；旋转蒸发仪(RE-52A，上海亚荣生化仪器厂)。

山柰酚对照品(批号：110861-201310)、槲皮素对照品(批号：100081-200907)，购自中国食品药品检定研究院；色谱甲醇；色谱乙腈；磷酸(分析纯)；纯净水等。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量测定

2.1.1 色谱条件 在文献[6]基础上调整，色谱柱：Agilent SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)和保护柱，流动相为甲醇-0.2%磷酸水溶液(55∶45)，检测波长360 nm，柱温35 ℃，流速1 mL/min。

图1 对照品(A)和样品(B)色谱(1.槲皮素；2.山柰酚)

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取适量槲皮素、山柰酚对照品，加甲醇制成每1 mL含槲皮素51.1 μg、山柰酚48.8 μg的溶液，即得。

2.1.3 标准曲线绘制 分别将对照品溶液稀释1、1.25、2、10、25、50倍，进样10 μL，记录峰面积。以对照品溶液浓度(μg/mL)为横坐标X，以峰面积为纵坐标Y进行线性回归。槲皮素和山柰酚的回归方程分别为：Y=42628X-11233，r=0.9999；Y=42486X-13625，r=0.9999。结果表明：槲皮素浓度在1.02～51.1 μg/mL范围内，山柰酚浓度在0.976～48.8 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。见图2、图3。

图2 槲皮素的标准曲线

图3 山柰酚的标准曲线

2.1.4 供试品溶液制备 (1)药材总黄酮含量测定。取0.5 g柿叶粉末，精密称定，加50 mL甲醇，称重，超声处理60 min，放冷并补足损失的重量，离心，精密吸取上清液10 mL，加甲醇-25%盐酸(2∶1)15 mL，加热回流30 min，放冷，转移至50 mL量瓶，加甲醇至刻度，滤过，取续滤液20 μL进样测定，柿叶总黄酮含量为0.43%。总黄酮含量=(A1+11233)/(42628×2000)+(A2+13625)/(42628×2000)，A1：样品槲皮素峰面积，A2：样品山柰酚峰面积。

(2)提取物总黄酮含量测定。精密称定样品0.1 g，加甲醇：25%盐酸溶液(2∶1)15 mL，加热回流30 min，冷却，转移至50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。总黄酮含量计算公式同上。

2.2 柿叶总黄酮提取工艺单因素考察

2.2.1 提取溶剂考察 称取20 g柿叶粉末5份，分别加入15倍量的0、30、50、75、95%的乙醇水溶液，加热回流2次，每次1.5 h，合并滤液，干燥得总黄酮粗提物，75%乙醇提取的黄酮纯度、得率较高，故选择75%乙醇为提取溶剂。结果见表1。

总黄酮得率=(提取物中总黄酮的质量/原料的质量)×100，粗提物中总黄酮纯度(提取物中总黄酮的质量/粗提物的质量)×100，后续实验中柿叶总黄酮得率及粗提物总黄酮纯度也按此法计算。

表1 提取溶剂考察结果 (%)

2.2.2 物料比考察 称取20 g柿叶粉末4份，分别加入8、10、15、20倍量的75%乙醇溶液，其他操作同“2.2.1”，综合黄酮纯度、得率及提取成本考虑，选择15倍量。结果见表2。

表2 提取溶剂考察结果

2.2.3 提取时间考察 称取20 g柿叶粉末3份，加入15倍量的75%乙醇溶液，分别加热回流0.5、1、1.5 h，其他操作同“2.2.1”项，提取1 h时黄酮纯度、得率最高，故选择1 h为提取时间。结果见表3。

表3 提取时间、次数的考察结果

2.2.4 提取次数考察 称取20 g柿叶粉末，加入15倍量的75%乙醇，加热回流3次，每次1 h，分别干燥滤液，称定3份浸膏的质量，综合考虑浸膏质量、黄酮纯度及成本，选择提取2次。结果见表3。

2.3 柿叶总黄酮纯化工艺研究

2.3.1 总黄酮粗提物制备 称取柿叶粉末40 g，加入15倍量75%乙醇，加热回流2次，每次1 h，抽滤，合并滤液，浓缩，冷冻干燥成浸膏，备用。

2.3.2 纯化工艺比较 (1)酸水解法。取浸膏1 g，精密称定，加入50 mL的水解液，水浴水解1 h(80 ℃，磁力搅拌)，离心，沉淀用水洗涤，收集上清液，干燥。5%硫酸水解液纯化的黄酮纯度及得率最高。结果见表4。

表4 水解液对黄酮纯化工艺的影响结果

(2)萃取法。取浸膏1 g，精密称定，加入15 mL水成混悬液，依次用1倍量石油醚、2倍量乙酸乙酯萃取6次，合并乙酸乙酯层，干燥，得浸膏0.24 g，黄酮纯度为12.6%。

(3)大孔树脂法。大孔吸附树脂预处理后，湿法装柱，取1 g浸膏，精密称定，用蒸馏水配制成浓度为3 mg/mL的溶液上柱，去离子水洗至流出液无色，依次按10、50、75%乙醇以1 BV/h流速洗脱，收集，干燥，计算浸膏质量及黄酮纯度。结果见表5。

表5 洗脱液对黄酮纯化工艺的影响结果 (%)

3 讨论

黄酮类化合物主要以苷类的形式存在，根据相似相溶原理，黄酮苷一般可溶于热水、甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂中，用乙醇提取黄酮类化合物是目前使用较多的一种方法[7-8]。柿叶总黄酮的提取方法较多，如林国荣等[9]采用水提法，固液比1∶10，温度75 ℃，提取时间2 h；吉俊生等[10]采用浓度为70%乙醇提取，料液比1∶10，提取时间为1 h，提取2次；杨露等[11]采用超声法提取，以40倍量的40%乙醇为溶剂，在60 ℃下超声50 min。尽管提取方法多样，但黄酮纯度及得率并不高。

本实验在此基础上研究了柿叶中总黄酮的提取工艺，采用单因素试验考察了提取所用溶剂、物料比、提取时间、提取次数，确定了最优条件为15倍量的75%乙醇加热回流2次，每次1 h。在柿叶总黄酮纯化工艺研究中，分别采用了萃取法、酸水解法、大孔树脂纯化法，发现依次用1倍量石油醚、2倍量乙酸乙酯分别萃取6次精制后的黄酮纯度为12.6%，回收率在95%以上。萃取法与其他方法相比工艺简单，成本低，效率较高，实用性较强。

柿叶为民间常用药材，资源十分丰富，其药用价值和保健作用越来越受到人们的重视，但柿叶的研究多侧重于有效成分的提取，对药理药效、制剂制备及其临床应用的深入挖掘甚少。今后应注重加强柿叶制剂的研发和临床应用的开发，尤其在研究较为成熟的心脑血管疾病领域开发出疗效显著的柿叶产品。