HPLC法测定喉症丸中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量

刘册家，王 真，刁瑞丽，岳 苏，孙珊珊，史 磊

(1.山东宏济堂制药集团股份有限公司，山东 济南 250103；2.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355)

喉症丸由蟾酥(酒制)、人工牛黄、冰片、猪胆汁、玄明粉、青黛等10味中药经提取、浓缩等过程制备而成，具有清热解毒、消肿止痛的功效，主要用于咽炎、喉炎、扁桃腺炎及一般疮疖。现行喉症丸标准为《部颁标准中药成方制剂第四册WS3-B-0848-91》文件，仅有薄层鉴别项目，质量标准检测项目较为简单。HPLC具有灵敏度好、分离效率高、易于操作和重复性好的特点。为了符合中药质量控制现代化的趋势及要求，本实验参照药品质量标准分析方法验证指导原则[1]，建立了喉症丸中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量的测定方法。方中蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍BufobufogargarizansCantor 或黑眶蟾蜍BufomelanostictusSchneider 的干燥分泌物，具有解毒、止痛、开窍醒神的功效，可用于治疗痈疽疔疮、咽喉肿痛、中暑神昏、痧胀腹痛吐泻[2]。现代药理学研究表明，蟾酥具有极强的镇痛[3]、强心[4-7]、抗菌[8-10]、抗肿瘤等[11-12]作用，临床应用广泛，可用于治疗多种恶性肿瘤、慢性乙型肝炎、急慢性呼吸道感染、心脏病等。蟾酥为该处方中的贵重药材，其有效成分为华蟾酥毒基和脂蟾毒配基，2种成分的含量与该制剂的有效性和安全性密切相关[13]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；CPA225D十万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)。

1.2 试药

喉症丸(山东宏济堂制药集团股份有限公司，批号：1708001、1701002、1703001、1703002、1703003)；华蟾酥毒基(中国食品药品检定研究院，批号：110803-201416)、脂蟾毒配基(中国食品药品检定研究院，批号：110718-201108)；乙腈(德国默克色谱纯)；磷酸二氢钾(天津市光复科技发展有限公司)；磷酸(成都市科龙化工试剂厂)；纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Thermo C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相乙腈-0.5%磷酸二氢钾(用磷酸调节pH=3.2)(40∶60)；流速1.0 mL·min-1；检测波长296 nm；柱温40 ℃；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取华蟾酥毒基、脂蟾毒配基对照品约15mg，精密称定，加甲醇分别制成各含华蟾酥毒基48.70、64.94、81.17、97.41、113.64 μg·mL-1和脂蟾毒配基9.23、12.30、15.38、18.45、21.53 μg·mL-1的对照品混合溶液，低温保存。

2.2.2 供试品溶液的制备 取喉症丸(1708001)适量，研细，取约0.65 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇20 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液制备 取组方中除蟾酥外的其他药材，参照喉症丸工艺制法同法小试，制得阴性对照溶液。

2.3 专属性试验

取“2.2”项下的对照品、供试品、阴性供试品溶液各10 μL，按“2.1”项色谱条件进样分析，在混合对照品溶液出峰位置处，专属性样品溶液未出现色谱峰，表明该方法专属性强。结果见图1。

2.4 线性关系考察

取“2.2.1”项下的5种不同浓度的混合对照品溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件进行测定。以对照品溶液浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，结果见表1，可知2种成分在各自的范围内线性关系良好。

图1 溶液HPLC色谱

表1 2种成分线性关系

2.5 重复性试验

取喉症丸样品(批号：1708001)，按“2.2.2”项下方法制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定。测得华蟾酥毒基和脂蟾毒配基平均含量为1.890 mg·g-1、0.983 mg·g-1，RSD为0.5%、0.7%，表明该方法重复性良好。结果见表2。

2.6 中间精密度

选择与“2.5”项下由不同人员和不同仪器，按“2.1”项下的色谱条件进行测试，测得华蟾酥毒基、脂蟾毒配基平均含量分别为1.895 mg·g-1、0.982 mg·g-1,RSD均为0.7%。结果见表3。

表2 重复性试验结果

表3 中间精密度试验结果

2.7 加样回收率试验

精密称取已知含量的喉症丸样品0.65 g(批号：1708001，华蟾酥毒配基1.890 mg·g-1，脂蟾酥毒配基0.983 mg·g-1)，共6份，分别加入混合对照品溶液(华蟾酥毒基1.081 mg·mL-1，脂蟾毒配基0.792 mg·mL-1)1 mL，按“2.2.2”项下供试品溶液方法制备待测溶液，进样10 μL，计算回收率。结果华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的平均回收率分别为101.3%、101.6%，RSD为1.0%、1.2%，准确度结果符合要求。见表4。

2.8 柱温耐用性考察

取“2.2”项下对照品和该项下方法制备的供试品溶液(批号：1701002)，按“2.1”项下色谱条件下进行柱温耐用性测定，色谱柱温度分别设置为38、39、40、41、42 ℃。结果表明在38～42 ℃柱温条件下，出峰时间随着温度的升高而变短，但含量变化不大，供试品中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的平均含量为1.953 mg·g-1、1.060 mg·g-1，RSD分别为0.8%、0.7%。在该温度条件范围内对结果无明显影响，可以满足检验需求。结果见表5。

表4 加样回收率试验结果 (n=6)

表5 柱温耐用性试验结果

2.9 流速耐用性考察

取“2.2.2”项下对照品和该项下方法制备的供试品溶液(批号：1701002)，按“2.1”项下色谱条件下进行流速耐用性测定，流动相流速分别设置为0.95、0.97、1.00、1.02、1.05 mL·min-1。结果表明在0.95～1.05 mL·min-1流速条件下，流速越小出峰时间越长，但含量变化不明显，供试品中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的平均含量分别为1.930 mg·g-1、1.086 mg·g-1，RSD均为0.4%。结果见表6。

2.10 样品测定

取3批不同批号的喉症丸样品，按“2.1”项色谱条件进行含量测定，结果见表7。从表中可以看出次3批样品中各成分的含量与批号1708001样品含量有差异，这是因为样品中方剂蟾酥(酒制)原料的投料批次不一致所导致的。

表6 流速耐用性试验结果

表7 含量测定结果 (mg/g)

3 讨论

本研究建立了HPLC测定喉症丸中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量测定方法，在流动相的选取过程中先后采用了乙腈-0.5%磷酸二氢钾(50∶50)、乙腈-0.5%磷酸二氢钾(40∶60)等方法，发现2种成分分离度差、色谱峰拖尾、峰宽等不良的系统适应性。为了达到较好的系统适应性，最终确定了乙腈-0.05%磷酸二氢钾(40∶60)流动相条件。同时考察了超声1～2.5 h之间超声时间对样品含量的影响，结果表明含量变化微小，故选择超声1h的提样时间。

用该方法测定3批喉症丸样品中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量，实验结果表明，本方法简单易行，重复性好，能够准确地用于喉症丸蟾酥含量控制，为喉症丸的原料和产品提供数据支持和技术保障。故该实验条件下的高效液相色谱法可作为喉症丸中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量测定的方法。