原料乳体细胞数对UHT乳贮藏期间品质的影响

林莹莹 任发政 王紫薇 何雨桐 郭慧媛*

（1 中国农业大学食品科学与营养工程学院 食品营养与人类健康高精尖创新中心 北京100083 2 教育部北京市共建功能乳品重点实验室 北京100083）

乳中体细胞数（Somatic cell count，SCC）是指每毫升乳中所含的体细胞总数[1]，是表征奶牛健康状态的重要指标。研究表明，原料乳中SCC 的高低与酶含量具有相关性[2]。在高SCC 的原料乳中，血纤维蛋白溶酶（Plasmin，PL）及脂肪酶的活性较高，且酶的耐热性强，这些酶可能会造成产品在货架期内发生凝胶[3]、脂肪上浮[4]等劣变现象。

近年来，关于原料乳SCC 对乳制品贮藏期品质影响的研究中，Santos 等[5]发现原料乳SCC 的上升，会加剧巴氏杀菌乳在贮藏期内蛋白质和脂肪的水解，使贮藏期明显缩短；Kelly[6]研究发现高SCC 和低SCC 原料乳生产的UHT 乳都有少量的PL 活性残留，且β-酪蛋白和αS1-酪蛋白都发生水解，然而均未出现凝胶现象；Auldist 等[7]研究发现高SCC 和低SCC 原料乳生产的UHT 乳在贮藏期间都发生了胶凝现象，他们认为UHT 乳胶凝现象的出现与蛋白水解程度无关。付文菊[8]发现25 ℃和37 ℃贮藏的UHT 乳在试验中很快出现了脂肪上浮，原料乳SCC 越高，UHT 乳贮存期间脂肪上浮越快。Strzalkowsk 等[9]的研究表明牛奶的脂肪水解与体细胞数和β4-防御素的多晶型形式相关。由此可见，关于体细胞数是否会引发UHT 乳蛋白质和脂肪水解，而这些水解作用又是否会造成蛋白凝胶和脂肪上浮这两个问题尚无定论。目前，中国原料乳收购标准中的体细胞数控制标准无据可依。

针对以上问题，本试验采集不同体细胞数的原料乳，通过间接加热制成UHT 乳产品进行贮藏期试验，跟踪测定纤维溶酶活性、蛋白质水解情况及黏度，同时测定脂酶活性、游离脂肪酸含量和脂肪球结构变化情况，探究体细胞数对UHT 乳贮藏期间的蛋白质和脂肪水解的影响，以及与产品凝胶和脂肪上浮现象的关系。为企业制定原料乳收购的体细胞数标准提供依据，同时为UHT 乳的品质控制提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采集体细胞数分别为30 万个/mL 和80 万个/mL 的原料乳，测定各项指标后，采用147 ℃、4 s间接灭菌法，经过无菌灌装加工成225 mL 的利乐砖UHT 乳。两个体细胞组各制备3 个批次的样品，置于20 ℃下贮藏180 d，每隔30 d 取样测定相应指标。

1.2 主要药品和试剂

巴比妥钠、p-硝基苯酚丁酸酯、EDTA 二钠、对硝基苯酚、三乙醇胺、硝酸铜、三氯甲烷、铜试剂（二乙基二硫代氨基甲酸钠）、 正丁醇、 磷酸二氢钾，北 京 化 工 厂；PMSF、6-氨 基 己 酸（EACA）、DMF、乳用澄清剂（clarifying agent for dairy products）、n-Suc-Ala-Phe-Lys-AMC，美国sigma 公司。

1.3 主要仪器与设备

LYNX4000 型低温高速离心机，美国Thermo Scientific 公司；RF5301 型荧光光度计、LC-20AT高效液相色谱仪，日本岛津公司；KDY-9830 全自动凯氏定氮仪，上海洪纪仪器设备有限公司；AR-1500ex 型旋转流变仪，美国TA公司；Infinite M200Pro 型多功能酶标仪，瑞士Team 公司；LS230型激光粒度分析仪，美国Backman 公司。

1.4 方法

1.4.1 纤维溶酶的测定 根据Harris 等[10]的方法进行改进，由酶解底物浓度变化反映纤溶酶活性。取1 mL 牛乳与1 mL 缓冲液混匀，室温放置60 min 后，于37 ℃保温10 min；取0.3 mL 混合液与0.3 mL n-Suc-Ala-Phe-Lys-AMC 溶液 （浓度为2.0 mmol/L）混匀，于37 ℃保温；每32 min，取0.1 mL 加入1 mL 去离子水，1 mL 澄清剂，混匀后进行荧光测定。测定条件：激发波长370 nm，发射波长440 nm，激发和发射狭缝宽度均为3 nm。共测定5 次，以测定时间为横坐标，荧光强度为纵坐标，做出荧光强度随时间变化的回归曲线，斜率为纤维溶酶活性，单位为U/mL。

1.4.2 蛋白质组成的测定 采用凯氏定氮法测定样品中的总氮、非蛋白氮和非酪蛋白氮。总氮的测定根据国标GB50095-2010 方法测定，非蛋白氮的测定采用AOAC991.21，非酪蛋白氮的测定采用AOAC927.3。

1.4.3 酪蛋白组成的测定 采用高效液相色谱法（RP-HPLC）测定酪蛋白组成[11]，取乳样40 mL，于4 000×g，4 ℃条件下离心20 min；除去上层脂肪，取0.4 mL 脱脂乳，加入1.6 mL 变性剂，混匀，静置15 min；溶液过0.45 μm 水系膜；取0.2 mL 溶液进行高效液相色谱分析，设定参数：流动相A 为含有0.11%三氟乙酸的超纯水，流动相B 为含有0.11%三氟乙酸的乙腈；C4 柱子 （5 μm，250 mm×4.6 mm，Kromasil）；柱温25 ℃；进样量60 μL；检测波长214 nm；流速0.8 mL/min；工作时间0～40 min内，流动相B 的含量从30%升至50%；40～42 min内，从50%升至100%；42～43 min 内，维持不变；43～46 min 内，从100%降至30%，再平衡5 min；共计51 min。

1.4.4 黏度的测定 采用AR-1500ex 型旋转流变仪，设定参数：温度25 ℃，转子Double gap cylinder，Gap 为4 000 mm，加样量5 mL。程序设置：预搅5 min，剪切速率从1 rad/s 升至100 rad/s；随后固定在100 rad/s，每10 s 测定一次黏度，共测定12 次，单位为mPa·s。

1.4.5 游离脂肪酸（FFA）的测定 采用铜皂法测定游离脂肪酸，具体步骤参照Ma 等[12]的方法。

1.4.6 pH 值的测定 采用梅特勒Delta320 型酸度计于室温下测定。

1.4.7 脂肪酶活性的测定 根据张树利[13]的方法进行改进，样品经低温离心脱脂，得到脱脂乳，0.5 mL 脱脂乳与2 mL 巴比妥缓冲液混匀，37 ℃保温15 min，加入底物50 μL，混匀后，37 ℃保温10 min，随后加入2 mL 酶抑制剂，混匀后于37 ℃水浴3～5 min。取出并吸取上述混合物200 μL 于酶标板内，采用酶标仪测定420 nm 处的吸光值。

1.4.8 粒径分布的测定 将200 μL 乳样注入到粒度分析仪中，在含100 mL 水的测定装置中稀释，当浓度达到8%时开始测定。利用动态光散射得到样品中的乳脂肪球粒径分布，并根据公式计算出其体积平均直径（d4，3）。

1.4.9 激光共聚焦显微镜（CLSM）测定脂肪球膜取样品乳45 mL，于3 000×g 条件下离心5 min，取0.02 g 脂肪，溶于模拟牛乳超滤液成脂肪球稀释液。取1 μL 尼罗红和快绿染料与200 μL 样液轻柔混匀，避光染色1 h。吸取10 μL 染好色的待测样，加20 μL 低熔点琼脂糖（质量分数0.5%）。然后在激光共聚焦显微镜上观察样品脂肪球膜状态，观察条件：Ar/Kr 激光源，63 倍目镜，荧光模式，尼罗红激发光源波长288 nm，快绿的激发光源波长633 nm，图片大小设置为512×512 像素。

1.4.10 数据处理方法 所有测定指标均重复3次，试验数据采用Excel（Microsoft Inc.，2013）整理和作图，采用SPSS Statistics（Version 21）统计软件进行单因素方差分析，数值以平均值±标准差表示，以P＜0.05 作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 原料乳的各项指标测定结果

6 批原料乳的各项指标结果见表1。低体细胞数组（LSCC）和高体细胞数组（HSCC）除体细胞数外，其余指标无差异。

表1 原料奶信息Table1 Information of raw milk

2.2 UHT 乳在贮藏期间的酶活性变化

由图1a 可知，两组UHT 乳在贮藏期间检测到的PL 活性都很低，稳定在0.01～0.06 U/mL 之间，而原料乳中PL 酶活分别是（6.00±0.01）U/mL和（8.23±0.10）U/mL，说明本试验采用的间接UHT方式，加热强度大，原料乳经过UHT 杀菌后，乳中的PL 基本完全失活，贮藏期间一直很低；这与Newstead 等[14]的报道一致，该研究中指出，UHT 间接加热杀菌比直接加热杀菌强度更大，经间接加热杀菌的UHT 乳中PL 基本完全失活。另外，在Huppertz 等[15]的报道中指出，β-乳球蛋白在经过UHT 加热后会发生变性，变性的β-乳球蛋白会与酪蛋白结合生成酪蛋白-β-乳球蛋白复合物，这种复合物会对PL 的活性有所抑制。这可能是本试验UHT 乳中PL 活性很低的原因之一。

经UHT 杀菌后，尽管PL 大部分被灭活，然而，在贮藏过程中残余的少量纤维溶酶酶原（PG）会被激活转化成PL。有报道表明，原料乳中PG 的含量随体细胞数的升高而升高[16]。因此，本研究中HSCC 组残留的PG 较高，在贮藏过程中逐渐转化为PL，故在贮藏第5、6 个月时，HSCC 组的PL 值高于LSCC 组。

图1 UHT 乳在贮藏期内的纤维溶酶和脂肪酶活性的变化Fig.1 Changes in plasmin and lipase activity of UHT milk with different SCC during storage period

由图1b 结果显示，两组体细胞数组的原料乳经过UHT 处理后，脂肪酶活性在0.03～0.06 U/mL之间，两组无显著性差异（P＞0.05）。原料乳中高、低体细胞组的脂肪酶活性分别是50.20±1.74 U/mL 和62.46±2.14 U/mL，可见经过UHT 处理后，脂肪酶活性大大降低。这与Choi 和付文菊等[17，9]报道相符，经过UHT 处理后，脂肪酶仅能保持少量的活性。此外，在UHT 乳贮藏期间，所有样品中的脂酶活性都没有显著性变化（P＞0.05）。

2.3 UHT 乳贮藏期间的蛋白水解

2.3.1 蛋白水解情况 UHT 乳贮藏期间以非蛋白氮占总氮的百分比（NPN/TN）表示真蛋白水解程度，以非酪蛋白氮占总氮的百分比（NCN/TN）表示酪蛋白水解程度。由图2可知，在UHT 乳贮藏期间，NPN/TN、NCN/TN 总体呈上升趋势，而从第5个月起两组样品的蛋白水解率和酪蛋白水解率开始出现显著性差异（P＜0.05），说明UHT 乳的蛋白水解程度随体细胞数的上升而加剧。

图2 UHT 乳在贮藏期内的NPN/TN 和NCN/TN 的变化Fig.2 Changes in NPN/TN and NCN/TN of UHT milk with different SCC during storage

2.3.2 各酪蛋白组分的水解情况 通过高效液相色谱法进行酪蛋白成分的分析，以此观察各酪蛋白组分的水解情况。由图3所示，在贮藏期间两组UHT 乳的各个酪蛋白组分均发生不同程度的水解，其中κ-酪蛋白和αS2-酪蛋白的水解程度最高，在贮藏第6 个月结束时，κ-酪蛋白和αS2-酪蛋白完整蛋白的峰面积降幅高达90%以上。

由图3a 和3b 可知，在贮藏期开始时HSCC组β-酪蛋白和αS1-酪蛋白的水解率略低于LCSS组，从第4 个月起β-酪蛋白和αS1-酪蛋白的水解率显著高于LSCC 组（P＜0.05），这可能是由于在贮藏后期HSCC 组的PL 活性高于LSCC 组，因此引发酪蛋白水解更为剧烈。由图3c 和3d 可知，两组样品的κ-酪蛋白和αS2-酪蛋白的水解程度无显著性差异（P＞0.05），并且两种酪蛋白的水解率在贮藏期的前4 个月均大幅上升，由于两体细胞组的原料乳中均有一定数量的嗜冷菌，故可推测嗜冷菌产生的蛋白酶也参与了蛋白水解。

2.3.3 UHT 乳贮藏期间的黏度变化 黏度是蛋白凝胶的表观指标，Kocak 等[18]发现当UHT 乳在贮藏期间的黏度突然跃升到10 mPa·s 以上时，表明出现了蛋白胶凝特性。

从图4可知，两组样品的黏度没有显著性差异（P＞0.05），均始终稳定在2.0～2.4 mPa·s 之间，没有出现突然跃升现象，说明两组样品均未出现蛋白凝胶现象。因此，UHT 乳中的酪蛋白虽然在贮藏期间发生了明显水解，但是蛋白水解片段之间并没有发生互相交联，没有形成凝胶。Kohlmann[19]和Kelly[6]通过试验证明，若乳中PL 活性很低或失活的情况下，不会引起UHT 乳胶凝现象，与本试验结果一致。

图3 UHT 乳在贮藏期内的（a）β-酪蛋白、（b）αS1-酪蛋白、（c）κ-酪蛋白、（d）αS2-酪蛋白的水解程度Fig.3 Degree of hydrolysis of （a） β-casein、（b） αS1- casein、（c） κ- casein and （d） αS2-casein of UHT milk during storage

贮藏期间，从酪蛋白胶束上水解释放下来的κ-酪蛋白与乳清中的β-乳球蛋白发生结合，形成β-κ-复合物，只有当β-κ-复合物在乳清相中聚集交联到一定程度才会形成凝胶，引发体系的黏度上升。结合本研究蛋白和酪蛋白水解的试验结果可以发现，尽管从液相色谱的结果可知两组样品中的酪蛋白在贮藏后期大量水解，失去了原有完整结构，然而体系中的NCN/TN 仅由6.26%±0.08%、6.10%±0.12%上升到7.86%±0.35%、8.15%±0.30%，表明酪蛋白的水解程度并不高，即水解产生的片段仍然存在于酪蛋白胶束中，没有进入到乳清相中变成可溶性氮。也正是由于这个原因，使得乳清相中没有形成足够的β-κ-复合物，因此没有形成凝胶。也有文献表明在UHT 间接加热时，由于加热强度大，β-乳球蛋白变性，使其变得稳定，并且乳清蛋白会附在酪蛋白表面，不仅会减少凝胶的位点，还能与酪蛋白结合生成抑制PL 活性的酪蛋白-β 乳球蛋白复合物，进而阻止UHT 乳的凝胶[20]。

2.4 UHT 乳贮藏期间的脂肪水解

2.4.1 UHT 乳贮藏期内的游离脂肪酸变化 在贮藏期间，脂肪水解程度用游离脂肪酸（FFA）含量来表示，如图5所示，两组UHT 乳的游离脂肪酸含量略有上升，然而与贮藏初期相比并无显著性差异（P＞0.05），即体系中的脂肪酶活性很低，因此尽管脂肪球表面的酪蛋白层发生水解，其内部的甘油三酯并未发生明显水解，样品中的游离脂肪酸增加不明显。Fernandes 等[21]在对贮藏期UHT 奶脂解情况的研究中也得到了相似结论，他们认为原料乳SCC 和贮藏期内UHT 乳中FFA 含量的关联性并不显著。

在6 个月的贮藏期中，各体细胞数pH 值均呈降低趋势。一般而言，脂肪水解生成的游离脂肪酸会使乳体系的酸度增加，然而从本研究结果来看，游离脂肪酸在增加酸度方面作用有限，仅使pH 值从6.8 下降到约6.5。

2.4.2 UHT 乳贮藏期间的脂肪球聚集情况 由图6可以看出，经过6 个月的贮藏期，HSCC 组包装盒顶部出现2～3 mm 的脂肪层，而LSCC 组包装盒顶部并未出现脂肪层。由图6可知，经过均质的UHT 乳在刚刚进入贮藏期时，乳中脂肪球的粒径分布为0.48～0.55 μm，随着贮藏时间的延长，脂肪球粒径出现明显增加。d4，3是基于体系中粒子体积计算得到的直径，该值对大直径粒子的变化更敏感，因此更适合用来表征脂肪球的变化。从d4，3粒径观测结果（图7b） 来看，UHT 乳脂肪球在第2个月粒径迅速增加，之后无明显变化。

图4 两组体细胞组UHT 乳在贮藏期内的黏度变化Fig.4 Changes in viscosity of UHT milk with different SCC during storage period

图5 UHT 乳在贮藏期内的游离脂肪酸含量变化Fig.5 The content change of free fatty acids of UHT milk during storage

图6 贮藏6 个月后的LSCC 组（a）和HSCC 组（b）的包装盒顶部脂肪层Fig.6 Top of the box fat layer of LSCC UHT milk （a） and HSCC UHT milk （b） after 6 months

图7 HSCC 组在6 个月的贮藏期粒径分布图和两组UHT 乳在贮藏期间d4，3 的变化Fig.7 The particle diameter distribution of HSCC milk during 6 months and d4，3 change of UHT milk during storage

UHT 乳经均质处理后，脂肪球的粒径变小，酪蛋白能在油水界面之间分散并覆盖在脂肪球表面形成蛋白层，使脂肪球均匀稳定地分散在乳中。UHT 乳贮藏过程中，乳中的蛋白酶能够水解酪蛋白，破坏乳脂肪球表面覆盖的酪蛋白层，引起脂肪球之间的聚集，最终发生相分离而出现脂肪上浮[13，22-23]。因此，可以通过对脂肪球形态和球膜完整性的观测，来了解脂肪球聚集情况。

用尼罗红和快绿对乳脂肪球和蛋白进行双染色，采用共聚焦显微镜观察，图像中红色为脂肪球，绿色是蛋白质，从图8a-8c 中可看出，在贮藏初期，UHT 乳体系中的脂肪球基本呈分散状态，且脂肪球膜上的绿色蛋白膜完整，清晰可见。经过6个月贮藏期，HSCC 组脂肪球表面的蛋白膜崩解，脂肪球互相黏连，聚集成团簇；而LSCC 组虽然也发生脂肪球膜蛋白水解，但是脂肪球并未出现显著聚集现象。脂肪球的聚集使得脂肪上浮，最终在UHT 乳的包装盒顶部形成脂肪层[23]。

图8 贮藏期开始（a）及6 个月后的LSCC 组（b）和HSCC 组（c）的乳脂肪球激光共聚焦显微图像Fig.8 Confocal laser scanning microscopy images of stained MFG of milk at the storage starting point （a）and after 6 months （b：LSCC UHT milk，c：HSCC UHT milk）

3 总结

研究结果表明，在间接UHT 加热方式处理条件下，UHT 乳在20 ℃贮藏6 个月发生了明显的蛋白水解，然而并没有形成蛋白凝胶；80 万个/mL 体细胞组在第4 个月以后出现了明显的脂肪上浮现象，而30 万个/mL 组没有发生脂肪上浮。因此，体细胞数是影响UHT 乳脂肪球稳定性的重要原因。为了保证UHT 乳的贮藏品质，建议在生产UHT乳时，应选用体细胞数低于30 万个/mL 的原料乳。

致谢：感谢中荷奶业发展中心的资助（资助编号SDDDC2014R01）。