矿泉水中微生物检测能力验证结果与分析

丁秀琼 黄 武 刘建芳 林锏锐 郑俏慧 杨 劲 刘 骁

（1.湛江海关技术中心 广东湛江 524000；2.中国检验认证集团广东有限公司湛江分公司）

1 前言

实验室能力验证是指利用实验室间指定检测数据的比对，确定实验室从事特定测试活动的检测能力[1]。中国合格评定国家认可委员会（CNAS）将能力验证作为评价实验室技术能力的重要方法之一，与现场评审构成了互为补充的两种能力评价技术[2]。实验室则将能力验证用作有效的外部质量控制方法，并将其作为内部质量控制的补充，持续监控实验室检测能力。2018年，本实验室参加由中国检验检疫科学研究院测试评价中心（ACAS）组织实施的矿泉水中微生物检测能力验证，取得了满意的结果。现对本次能力验证活动进行总结分析，以持续提升实验室检测能力。

2 材料与方法

2.1 样品

本次矿泉水微生物能力验证包含4 个项目，每个项目2 个样品。真空西林瓶内装白色冻干物，复原后即为人工污染的矿泉水样品。由中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供，项目名称、项目代码及对应样品标识分别为大肠菌群ACAS-PT550：18-R848、18-J093； 铜绿假单胞菌 ACAS-PT551：18-N468、18-U473； 粪链球菌 ACAS-PT552：18-J636、18-K197； 产气荚膜梭菌 ACAS-PT553：18-H425、18-S133。

2.2 仪器与试剂

HFsafe-1500 LC 型生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司）；GHP-9160 型隔水式恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；GR110DR 型立式高压蒸汽灭菌器（美国ZEALWAY）；VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定/药敏分析系统（法国生物梅里埃公司）；DM4B 型leica 数字显微镜（上海徠卡显微系统贸易有限公司广州分公司）；微生物过滤系统（美国密理博）；ZF-1B 型紫外分析仪（上海汗诺仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（瑞士Salvislab）；智能气体工作站Anoxomat MARKⅡ（荷兰MART 公司）。乳糖胆盐发酵培养基（批号：160829）；亮绿乳糖胆盐培养液（BGLB）（批号：170830）；KF 链球菌琼脂培养基（批号：171008）； 脑心浸萃液体培养基（批号：180412）；脑心浸萃琼脂培养基（180412）；假单胞菌琼脂基础培养基/CN 琼脂（批号：180512）；金氏 B 培养基（批号：170921）；亚硫酸盐-多黏菌素-磺胺嘧啶琼脂（SPS）（批号：160512）；液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）（批号：180105）；动力-硝酸盐培养基（180504）；含铁牛奶培养基（批号：180612）； 卵黄琼脂培养基（批号：180409）；乙酰胺肉汤（批号：180413）；钠氏试剂（批号：180510）；3%过氧化氢酶试剂（批号：180710）；胆汁肉汤（批号：180727）；美国密理博，直径 47 mm，孔径 0.45 μm 滤膜（批号：F4BA80390）；杭州吉沃，直径 47 mm，孔径 0.45 μm（批号：20180702）、0.22 μm 滤膜（批号：20180608）；VITEK 2 革兰氏阴性细菌鉴定卡（GN）（批号：2410252413）；VITEK 2 革兰氏阳性细菌鉴定卡（GP）（批号：2420689403）；VITEK 2 革兰氏厌氧菌及棒状杆菌鉴定卡（ANC）（批号：244069920）。VITEK 2 细菌鉴定卡由法国生物梅里埃提供，其余试剂均购自北京陆桥技术股份有限公司。

2.3 方法

按照ACAS 《矿泉水中微生物检测能力验证作业指导书》进行样品处理，按GB 8538—2016《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》[3]55～58条款进行样品检测，采用VITEK 2 Compact 全自动微生物生化鉴定系统进行菌株鉴定，综合以上试验结果出具报告。同时以粪肠球菌ATCC19433、大肠埃希氏菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、荧光假单胞菌ATCC49642、产气荚膜梭菌CICC22949作为对照菌进行阳性和阴性对照试验。试验全过程按照GB 19489—2008《实验室生物安全通则要求》[4]在生物安全柜中无菌操作进行。

2.3.1 样品水化

待样品恢复至室温后，开启样品（西林瓶包装），立即加入20 mL 无菌水进行再水化，待溶解后，吸出放入无菌瓶中，再反复用余下的无菌水清洗西林瓶内壁（共520 mL 无菌水），回收清洗液放入上述无菌瓶中，此溶液即是待测样品原液，等同于520 mL 的待测矿泉水样品。

2.3.2 大肠菌群多管发酵法检测

（1）推测性检验：以无菌操作取10 mL 水样，加入10 mL 双料乳糖胆盐发酵培养液中；取1 mL 水样，加入10 mL 单料乳糖胆盐发酵培养液中； 取1 mL 水样，加入9 mL 无菌生理盐水中，混匀，吸取此稀释水样1 mL，加入10 mL 单料乳糖胆盐发酵培养液中；继续稀释水样并接种到单料乳糖胆盐发酵培养液中，共接种5 个稀释梯度，每个梯度接种5份，36℃培养25 h，观察每管是否产气。若有气体产生，该管则为推测性检验阳性，需进行确证性试验；若不产气则为阴性。

（2）确证性试验：自推测性检验阳性管中取一管培养液转接BGLB 管，36℃培养48 h，观察有无气体产生。若有气体产生，则为大肠菌群阳性；若无气体产生，则为大肠菌群阴性。记下BGLB 阳性管数及对应稀释梯度，查最可能数（MPN）表，得出水样中大肠菌群的MPN 值。

2.3.3 粪链球菌检测

（1）推测性检验：用0.45 μm 的滤膜分别过滤10 mL、25 mL、50 mL、100 mL、250 mL 待测样液原液，每个接种量都先加到一定量的无菌水中，使其最终体积为250 mL，然后过滤，以无菌操作方法将滤膜贴于KF 链球菌琼脂平板表面，倒置，36℃培养48 h；观察平板菌落形态，挑取5 个以上可疑菌落进行革兰氏染色并镜检。根据菌落特征符合情况计数所取水样中的典型菌落数。用无菌生理盐水清洗杯壁并过滤，同时用自制加标水样做对照。

（2）确证性试验：从平板上挑取5 个以上可疑菌落接种到脑心浸萃琼脂培养基斜面，36℃培养24～48 h，挑取所生长菌落进行氧化氢酶试验、45℃生长试验及胆汁肉汤试验。同时采用VITEK 2 Compact全自动微生物生化鉴定系统鉴定可疑菌落。综合以上结果计算每250 mL 水样中的粪链球菌数。

2.3.4 铜绿假单胞菌检测

（1）推测性检验：采用 0.45 μm 的滤膜分别过滤10 mL、25 mL、50 mL、100 mL 及 250 mL 待测样液原液，每个接种量都先加到一定量的无菌水中，使其最终体积为250 mL，然后过滤，以无菌操作方法将滤膜贴于CN 琼脂选择性培养基上，放于36℃培养24～48 h，观察菌落形态并计数。用无菌生理盐水清洗杯壁并过滤，同时用自制加标水样做对照。分别计数以下3类CN 琼脂上生长的菌落：显蓝色或绿色的疑似菌落（A）、产荧光的非蓝/绿脓色菌落（B）、红褐色菌落（C）。

（2）确证性检验：A类菌落进行绿脓菌素确证性试验；B类菌落进行乙酰胺肉汤确证性试验；C类菌落进行氧化酶测试、乙酰胺肉汤、金氏B 培养基确证性试验。同时，采用VITEK 2 Compact 全自动微生物生化鉴定系统鉴定可疑菌落。根据确证性试验确证结果计算250 mL 水样中铜绿假单胞菌数。

2.3.5 产气荚膜梭菌检测

（1）推测性检验：用孔径 0.22 μm 的滤膜分别过滤 10 mL、25 mL、50 mL 待测样液原液，每个接种量都先加到一定量的无菌水中，使其最终体积为50 mL，然后过滤，以无菌操作方法将滤膜贴于SPS 琼脂选择性培养基上，置于36℃厌氧培养24 h，计数黑色菌落。用无菌生理盐水清洗杯壁并过滤，同时用自制加标水样做对照。

（2）确证性检验：挑取5 个黑色菌落接种到FT培养基，36℃培养18～24 h，对培养物进行革兰氏染色镜检等确证性试验。同时采用VITEK 2 Compact全自动微生物生化鉴定系统鉴定黑色可疑菌落。综合以上结果计数并计算每50 mL 水中产气荚膜梭菌数量。

3 结果

3.1 大肠菌群

实验室采用多管发酵法检测矿泉水中的大肠菌群，每个样品接种 10 mL、1 mL、0.1 mL、0.01 mL、0.001 mL 5 个稀释梯度，结果见表1。报送结果时参照GB 4789.39—2013 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 粪大肠菌群计数》 附录B 确定最适稀释度，样品18-R848 大肠菌群检测结果为2400MPN/100mL，统计量（Z）=-1.1；样品 18-J093 大肠菌群检测结果为 1 300 MPN/100 mL，Z=1.3。两样品结果满意。

表1 大肠菌群检测结果

3.2 粪链球菌

参照能力验证作业指导书稀释倍数不超过100 倍原则，选取过滤 10 mL、25 mL、50 mL、100 mL 及 250 mL 5 个水样量过滤，结果见表2。该项目样品目标菌纯度较高，KF 链球菌平板上呈现典型的红色圆形菌落，革兰染色为阳性球菌，过氧化氢酶阳性，45℃生长试验阳性，胆汁肉汤试验生长阳性，VITEK 2 革兰氏阳性鉴定卡鉴定为98%粪链球菌。菌落形态及生化反应结果同阳性对照菌株一致。选取菌落数在20～100 CFU 的滤膜计数，最终结果报告为样品18-样品 18-结果满意。

表2 粪链球菌检测结果

3.3 铜绿假单胞菌

选取 10 mL、25 mL、50 mL、100 mL 及 250 mL 5 个水样量过滤，结果见表3。铜绿假单胞菌2 个样品中，样品N468 杂菌较多，10 mL 水样量平板勉强能计数，CN 琼脂平板上目标菌为透明非绿色产荧光菌落，杂菌为黄色菌落，产荧光菌落乙酰胺肉汤试验阳性；样品U473 杂菌也添加了杂菌，目标菌在CN琼脂平板上为绿色菌落，直接计数。菌落形态及生化反应结果同阳性对照菌株一致。目标菌落用VITEK 2 革兰氏阴性鉴定卡鉴定为99%铜绿假单胞菌，黄色杂菌鉴定为91%浅黄假单胞菌。最终结果报告为样品 18-N468：400 CFU/250 mL，Z=-1.5，样品 18-U473：680 CFU/250 mL，Z=-1.7，结果满意。

表3 铜绿假单胞菌检测结果

3.4 产气荚膜梭菌

产气荚膜梭菌样品也添加了杂菌，试验过程中贴滤膜后未在滤膜上再倾注一层SPS 琼脂培养基，厌氧培养后菌落黑色并不明显，SPS 琼脂平板上呈灰色，与杂菌色差不明显，革兰氏染色为革兰氏阳性粗大杆菌，动力试验阴性，生化反应结果同阳性对照菌株一致。VITEK 2 革兰氏厌氧菌鉴定卡鉴定为97%产气荚膜梭菌，结果如表4所示。综合以上结果可知，报告样品 18-S133：140 CFU/50 mL，Z=-0.1，2.0；样品 18-H425：37 CFU/250 mL，Z=-0.3，结果满意。

表4 产气荚膜梭菌检测结果

4 讨论

矿泉水中微生物检测能力验证（ACAS-PT550/551/552/553）技术报告可以看出结果满意率与试验设计难度一致。ACAS-PT550 矿泉水中大肠菌群检测有29 家实验室参加，28 家实验室结果满意，结果满意率96.6%，1 家实验室结果可疑；试验设计添加菌株为蜡样芽孢杆菌（DM423）、大肠埃希氏菌（ATCC8739）、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、肺炎克雷伯菌(ATCC 10031)、阴沟肠杆菌(ATCC13047)、粪链球菌(ATCC29 212)，其中大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌为大肠菌群类细菌；两组样品添加菌株相同，添加数量不同，一组指定值为4900 MPN/100mL，另一组样品指定值为700 MPN/100 mL。实验室检测过程中产气情况易于观察，只需多做2～3 个稀释度，查表时再确定最适稀释度，检测难度不大，重点注意样品水化及稀释过程。ACAS-PT551 矿泉水中铜绿假单胞菌检测有56 家实验室参加，46 家实验室结果满意，8 家实验室结果不满意，2 家实验室结果可疑，满意率82.1%；该组样品设置了Ⅰ～Ⅲ3 个不同数量组，其中，第Ⅰ组指定值为1 400 CFU/250 mL、第Ⅱ组指定值为3400 CFU/250 mL、第Ⅲ组为阴性样品，需要实验室给出 0 CFU/250 mL 或者＜1 CFU/250 mL 结果； 第Ⅰ组和第Ⅱ组样品添加菌株相同，添加数量不同，所添加蜡样芽孢杆菌、大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌种类与大肠菌群项目相同，添加铜绿假单胞菌为ATCC9027； 第Ⅲ组样品添加弗氏柠檬酸杆菌（ATCC8090）替代铜绿假单胞菌。本实验室在检测过程中发现第Ⅱ组不但目标菌添加浓度高，也添加了较多的杂菌，加大了目标菌的计数难度。ACASPT552 矿泉水中粪链球菌检测有20 家实验室参加，18 家实验室结果满意，2 家实验室结果不满意，满意率90.0%； 试验设计添加菌株为蜡样芽孢杆菌（DM423）、大肠埃希氏菌（ATCC8739）、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、肺炎克雷伯菌(ATCC10031)、弗氏柠檬酸杆菌（ATCC8090）、粪链球菌(ATCC29212)，两组样品添加菌株相同，添加数量不同，一组指定值为1 770 CFU/250 mL，另一组为 750 CFU/250 mL。粪链球菌样品目标菌纯度高，添加浓度适中，平板选择性强，生长目标菌落颜色鲜明易于观察计数，检测较为容易。ACAS-PT553 矿泉水中产气荚膜梭菌检测有26 家实验室参加，18 家实验室结果满意，7 家实验室结果不满意，1 家实验室结果可疑，满意率为69.2%；试验设计添加菌株为蜡样芽孢杆菌（DM423）、大肠埃希氏菌（ATCC8739）、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、阴沟肠杆菌(ATCC13047)、产气荚膜梭菌（ATCC13124），两组样品添加菌株相同，添加数量不同，一组指定值为48 CFU/50 mL，另一组为153 CFU/50 mL。产气荚膜梭菌属于厌氧菌，除了杂菌（蜡样芽孢杆菌兼性厌氧）干扰外，对实验室的厌氧设备有较高要求，否则无法形成黑色菌落，导致漏检。

本轮能力验证4 个项目均为定量项目，但除了大肠菌群不需要生化鉴定，其他3 个项目的计数均建立在对目标菌的鉴定确证基础上，是定量检测和定性检验综合能力测试。本实验室结果均为满意，但仍有值得注意的地方：（1）尽可能将所有样品全部使用，并多设计几个稀释梯度，以找到适宜计数范围内的平板，尤其是添加了高浓度杂菌的样品。（2）样品稀释方法有很多种，如传统的1 mL 加到9 mL 的10 倍梯度稀释，也有50 mL 加到200 mL 的倍比稀释，也可以只计接种量而对样品进行适当的稀释，无论哪种稀释方法都需要混合均匀且尽量减少样品的损失。（3）平板培养后一定要及时观察，最好每天计数1 次，防止菌落蔓延遮掩整个平板，导致无法计数。如果有条件的实验室可以采用微生物数码显微培养计数系统，提高计数的准确度。（4）滤膜法可以检测体积较大的水样，但不适合检测浑浊度高及非目标菌密度大的水样。本次能力验证中铜绿假单胞菌样品就属于非目标菌密度大的水样，过滤后导致滤膜上非目标菌密集，遮盖目标菌，影响计数，可用酶底物法[5]进行辅助检验。而对于产气荚膜梭菌一类厌氧菌，最好在贴好的滤膜表面再倾注一层SDS 琼脂培养基[6,7]，或将滤膜反贴于SDS 培养基上，以确保厌氧条件，形成典型黑色菌落，防止漏检。还可以参照使用夏威夷卫生部门的双套管法检测[8]。（5）对目标菌的检验除采用传统鉴定方法，还可以借助显色培养基[9]、酶联免疫法[10]、PCR 法[11，12]、环介导等温扩增（LAMP）法[13]、全自动微生物生化鉴定系统[14]、全自动微生物基因指纹鉴定系统[15]、基质辅助激光解吸附电力飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）法[16]等方法进行辅助检验鉴定。（6）试验过程中按要求设置对照，出现问题方便查找原因；同时参照海洋水质检验方法[17]及相关文献[18]设置平行对照。

能力验证是判断和监控实验室能力的有效手段之一，是实验室质量管理和检测技术的综合体现。实验室应该积极参与、认真对待每次能力验证，并对能力验证结果进行分析总结，不断提升自身管理能力和技术水平。